Orientador: Cristina Pontes Vicente

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: As células progenitoras endoteliais (CPEs) foram descritas por Asahara et al. (1997), isoladas a partir do sangue periférico e são células originadas da medula óssea. Estas células podem ser reconhecidas pela expressão de marcadores como o CD34, CD133, VEGFR2 e o CD31, pela capacidade de...

Resumo: As células progenitoras endoteliais (CPEs) foram descritas por Asahara et al. (1997), isoladas a partir do sangue periférico e são células originadas da medula óssea. Estas células podem ser reconhecidas pela expressão de marcadores como o CD34, CD133, VEGFR2 e o CD31, pela capacidade de internalização de acLDL e de formar estruturas semelhantes a vasos quando cultivas em matrizes tridimensionais. Quando ocorrem lesões endoteliais, elas podem ser mobilizadas da medula migrando para o sangue periférico e atuar no local da lesão arterial, podendo se diferenciar em células endoteliais maduras e promover a re-endotelização do vaso lesionado. Contudo, estas células estão presentes na medula óssea e no sangue periférico em quantidade muito pequena, 0,1 e 0,01% do total de células respectivamente, o que leva diversos grupos de pesquisa buscarem selecionar e cultivar estas CPEs visando aumentar seu número para melhor caracterizá-las in vitro e in vivo. Em nosso trabalho, buscamos estabelecer um meio de cultura capaz de sustentar o crescimento, proliferação e diferenciação das células progenitoras endoteliais isoladas a partir de medula óssea de camundongos C57bl/6, e de caracterizar seus vários estágios de diferenciação destas células em diferentes tempos de cultura. Para tal, células mononucleares foram isoladas da medula de camundongos C57bl/6 por gradiente de Ficoll-Paque PLUS e cultivadas por 3, 7 e 14 dias em meios de cultura diferentes acrescidos de diferentes fatores de crescimento (VEGF, IGF, bFGF e EGF) com concentrações variadas. Dentre todos os meios testados, o DMEM1-M1 (DMEM com vermelho de fenol acrescido de VEGF, IGF e bFGF) foi o que apresentou melhores resultados para os ensaios de proliferação, de viabilidade celular por DAPI, Azul de Tripan e MTT. A partir deste meio foram realizados testes para verificar a expressão de marcadores celulares (CD133, CD34, VEGFR-2 e CD31) por imunocitoquímica, imunofluorescência, Western Blotting e citometria de fluxo. Os resultados de imunocitoquímica e imunofluorescência foram positivos para todos os marcadores, em todos os períodos analisados. A análise por Western Blotting confirmou a expressão destes marcadores, com aumento na expressão de 3 para 7 dias de cultura. Por citometria de fluxo analisamos o perfil destas células em cultura de 7 dias comparando com as células in vivo, e conseguimos visualizar um aumento principalmente na freqüência de células que expressam VEGFR-2, um indicativo de que o meio utilizado está selecionando células progenitoras. A internalização de acLDL que também indica CPEs foi positiva após 7 e 14 dias. As células cultivadas em Matrigel® formaram estruturas semelhantes a vasos após 7 dias de cultura. Nossos resultados indicam que fomos capazes de estabelecer um meio de cultura eficiente na seleção e proliferação de CPEs, inibindo sua diferenciação inicial em células endoteliais, o que nos permitirá utilizar esta técnica de cultura para expandir o número de CPEs obtidas da medula óssea e poder utilizá-las no tratamento de lesões arteriais e em diferentes processos de terapia celular

Abstract: Endothelial progenitor cells (EPCs) were described by Asahara et al. (1997) isolated from peripheral blood, these cells are derived from bone marrow. EPCs can be characterized by the expression of cellular markers like CD34, CD133, VEGFR2 and CD31, internalization of acLDL and formation of...

Abstract: Endothelial progenitor cells (EPCs) were described by Asahara et al. (1997) isolated from peripheral blood, these cells are derived from bone marrow. EPCs can be characterized by the expression of cellular markers like CD34, CD133, VEGFR2 and CD31, internalization of acLDL and formation of structures similar to vessels when culture in tridimensional matrices. In the presence of endothelial lesion, they can be mobilized from bone marrow, migrating to peripheral blood and subsequently the endothelial lesion site. They can differentiate into mature endothelial cells and participate in the re-endothelization of the damaged vessel. However these cells are rare in bone marrow and peripheral blood 0,1 and 0,01%, respectively, several research groups are trying to develop strategies to isolate and cultivate these cells to better determine their characteristics in vitro and in vivo. In our study we tried to establish a culture medium able to sustain growth and proliferation of EPC obtained from C57bl/6 mice bone marrow and characterize the stages of differentiation that they could present in different times of culture. In order to do it, we isolated mononuclear cell from bone marrow using a Ficoll-Paque PLUS gradient and cultivated then for 3, 7 and 14 days using culture mediums with different compositions and concentrations of growth factors (VEGF, IGF, bFGF, EGF). Cellular growth determined by DAPI, trypan blue counting and MTT was more significant with the medium we named DMEM1-M1 (with VEGF, IGF and bFGF). Results obtained with immunocitochemistry and immunofluorescence with this medium was positive in all culture times. Western blotting demonstrated the expression of VEGFR2, CD34 and CD133 in 3 e 7 day, with a litte increase after 7 days. Flow citometry analysis of cells after 7 days in culture demonstrated an increase in cells expressing VEGFR2, indicating the selection of EPC with this medium. Internalization of acLDL and formation of structures similar to vessels were observed after 7 and 14 days in culture and confirms differentiation of mononuclear cells into EPC. So, in conclusion, our results indicate that we developed a culture medium able to sustain proliferation and differentiation of EPCs, inhibiting their terminal differentiation what will allow us to use this culture technique to increase the number of EPC from bone marrow obtained and in the future use these cells in the treatment of arterial lesions in different process of cellular therapy