Orientador: Paulo Pinto Joazeiro

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Ao final da gestação, a sínfise púbica de camundongo passa por um profundo relaxamento para favorecer a passagem dos fetos durante o parto. Este evento envolve a reabsorção dos ossos púbicos, a diferenciação celular e a remodelação da fibrocartilagem que culmina na formação e relaxamento do...

Resumo: Ao final da gestação, a sínfise púbica de camundongo passa por um profundo relaxamento para favorecer a passagem dos fetos durante o parto. Este evento envolve a reabsorção dos ossos púbicos, a diferenciação celular e a remodelação da fibrocartilagem que culmina na formação e relaxamento do ligamento interpúbico. Estes acontecimentos estão sob a influência do estrógeno, da progesterona e da relaxina. A remodelação do ligamento interpúbico ocorre, principalmente, por ação das metaloproteinases, que podem ser ativadas por diversos indutores, como o óxido nítrico (NO). Ele é um dos agentes que contribuem para o amolecimento cervical no momento do parto. Tendo em vista tal fenômeno, este trabalho teve por objetivo investigar o papel do gás NO na remodelação da sínfise púbica durante a gestação. Este gás é produzido pela óxido nítrico sintase e de acordo com sua concentração no tecido, pode induzir a proliferação ou a morte celular programada. Para avaliar o efeito do NO na remodelação do ligamento interpúbico, foram utilizados camundongos fêmeas no 18° e 19° dias de gestação. Fêmeas virgens formaram o grupo controle. As sínfises e/ou ligamentos interpúbicos foram coletados, processados e caracterizados pela coloração do Tricrômico de Masson. Utilizou-se anticorpo monoclonal específico para a proteína iNOS (óxido nítrico sintase induzível) para evidenciar sua distribuição nos tecidos interpúbicos tanto pela imunoistoquímica (microscopia de luz) quanto pela imunocitoquímica (microscopia eletrônica). Para a quantificação do NO foi utilizada a reação calorimétrica de Griess. Nos ensaios de imunoistoquímica, as fêmeas no D18 e D19 apresentaram positividade para iNOS nas células semelhantes a fibroblastos no ligamento interpúbico, inclusive naquelas que estavam em processo de divisão celular. Além disso, a imunomarcação para iNOS foi observada, também, nos condrócitos hipertróficos da cartilagem hialina. Nas fêmeas no D18, no entanto, a marcação foi mais freqüente e intensa quando comparada ao grupo D19. Nas fêmeas no D18, a imunocitoquímica demonstrou a localização intracelular da proteína iNOS. Ela foi encontrada no núcleo, em vesículas citoplasmáticas e sobre as membranas do retículo endoplasmático granular (REG). Nas fêmeas virgens, a imunomarcação foi observada nos condrócitos hipertróficos e em parte dos condrócitos nas transições fibrocartilaginosas. Diferentemente da imunoistoquímica, na reação de Griess, a quantidade de NO foi significativamente maior nas fêmeas do D19, o que indica maior atividade da enzima neste dia. Durante a gestação, a sínfise púbica passa por um balanço dinâmico entre a proliferação e a morte celular programada. Sugere-se que o NO tenha participação nestes eventos e apresente efeitos antagônicos na sínfise púbica. A imunomarcação intensa para iNOS observada nos condrócitos hipertróficos em ambos os dias de gestação, é indicativo de que há um acúmulo de NO nestas células resultando no estresse oxidativo. Acredita-se que o estresse oxidativo esteja envolvido no processo de morte dessas células. Em contrapartida, a imunomarcação nas células semelhantes a fibroblastos pode estar relacionada à desdiferenciação, proliferação e sobrevivência celular. A estas evidências se soma a imunolocalização da iNOS nas células em processo de divisão celular no ligamento interpúbico. Pode-se sugerir, também, que o NO participe do relaxamento do ligamento interpúbico ao final da gestação, pois este gás pode ativar as metaloproteinases. Além disso, a distribuição intracelular da iNOS aliada à maior produção de NO sugere fortemente que este gás tenha alguma participação no processo de morte das células semelhantes a fibroblastos no último dia de gestação. Os resultados qualitativos da imunomarcação da iNOS quando confrontados com aqueles quantitativos referentes à produção do NO no D18, permitem inferir que neste dia a enzima ainda se encontra na forma inativa ou parcialmente inibida. Porém, no D19 a enzima apresenta maior atividade, pois ocorre o pico de NO

Abstract: At late pregnancy, mouse pubic symphisis undergoes a deep remodeling that allows a safe parturition. This event involves the pubic bone resorption, cell differentiation and remodeling of fibrocartilage that culminates in the formation and relaxation of interpubic ligament. These events are...

Abstract: At late pregnancy, mouse pubic symphisis undergoes a deep remodeling that allows a safe parturition. This event involves the pubic bone resorption, cell differentiation and remodeling of fibrocartilage that culminates in the formation and relaxation of interpubic ligament. These events are under the influence of estrogen, progesterone and relaxin. Interpubic ligament remodeling occurs mainly by metalloproteinases, which can be activated by various inducers, it is recognized as of great potential nitric oxide (NO). It is one among others agents that contribute to cervical softening at parturition. In view of this phenomenon, this study aimed to investigate the role of NO gas in the remodeling of the pubic symphysis during pregnancy. This gas is produced by nitric oxide synthase and, according to its concentration in the tissue, can trigger both programmed cell death or proliferation. To evaluate the effect of NO on interpubic ligament remodeling, female mice were used in the 18th and 19th days of pregnancy. Virgin females constituted the control group. The symphysis and/or interpubic ligaments were collected, processed and characterized by Masson Tricromic staining. We used a specific monoclonal antibody for the protein iNOS (inducible synthase nitric oxide) to reveal its distribution in interpubic tissue by both immunohistochemistry (structural analysis / light microscopy) and immunocytochemistry (ultrastructural analysis / electron microscopy). For the quantification of NO was used Griess calorimetric reaction. In immunohistochemical tests, females at D18 and D19 showed iNOS immunostaining fibroblasts-like cells in interpubic ligament, including those that were in cell division process. Furthermore, iNOS immunostaining was also observed hypertrophic chondrocytes of hyaline cartilage. However, In females on the D18, the staining was more frequent and intense when compared with the group D19. In females at D18, ultrastructural analysis demonstrated the intracellular localization of iNOS protein. It was found in the nucleus, in cytoplasmic vesicles and on the rough endoplasmic reticulum (RER) membranes. In virgin females, the immunostaining was observed in hypertrophic chondrocytes and chondrocytes in the fibrocartilaginous transitions.Unlike immunohistochemistry, the Griess reaction for NO detection showed that the gas concentration was significantly higher in females D19, which indicates higher enzyme activity on this day. During pregnancy, the pubic is going through a dynamic balance between proliferation and programmed cell death. It is suggested that NO plays a role in these events and show antagonistic effects at the pubic symphysis. The intense immunostaining for iNOS observed in hypertrophic chondrocytes in both days of pregnancy, suggests that there is an accumulation of NO resulting in oxidative stress. It is believed that oxidative stress is involved in the process of death of these cells. In contrast, immunostaining in fibroblasts-like cells may be related to dedifferentiation, proliferation and cell survival. These suggestions sounds consistent, since cells in mitosis in the ligament had interpubie immunostaining for iNOS. It might be suggested also that NO participates in the relaxation of the interpubic ligament at late pregnancy, because this gas can activate metalloproteinases. Furthermore, the intracellular distribution of iNOS coupled with increased NO production strongly suggests that this gas has some involvement in fibroblast-like cell death in the last day of pregnancy. The qualitative results of immunostaining for iNOS when compared with those relating to the quantitative production of NO in D18, indicates that this day is the enzyme in its inactive form or partially inhibited. However, the D19 has increased the enzyme activity because the peak occurs NO