Orientadores: Áureo Tatsumi Yamada, Michael Joseph Soares

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Um processo de remodelação progressiva da vascularização uterina precede a placentação em humanos e roedores para prover o suprimento sanguíneo adequado na interface materno-fetal, tendo as células NK um papel modulador através da produção de citocinas como o IFN'gama', fatores de...

Resumo: Um processo de remodelação progressiva da vascularização uterina precede a placentação em humanos e roedores para prover o suprimento sanguíneo adequado na interface materno-fetal, tendo as células NK um papel modulador através da produção de citocinas como o IFN'gama', fatores de crescimento como o VEGF e radicais livres como o óxido nítrico (NO). A regulação das células uNK nesta atividade tem sido atribuída à influência de fatores exógenos como a hipóxia e parácrinos como a prolactin-like protein-A (PLP-A). Contudo, como estes mecanismos são integrados no controle da angiogênese e vasculogênese da interface materno-fetal envolvendo as células uNK não são plenamente compreendidos. No presente trabalho, foram investigadas experimentalmente a resposta das células uNK relacionadas com os mecanismos de regulação dos fatores angiogênicos sob influência da hipóxia no período pré-placentário. Para tanto, foram avaliados camundongos CD1 e geneticamente modificados IL15-/-, PLPA-/- e IL15-/-/PLPA-/- gestantes no 8° dia de gestação (dg), mantidos em hipóxia (42 0Torr - 11%O2) durante 48 horas. Em comparação com os animais mantidos em normóxia (760Torr - 21%O2) a quantidade de sítios anormais apresentou incremento estatisticamente significativo sob hipóxia nos animais CD1, porém este índice era substancialmente maior nos animais depletados dos genes IL15 e PLPA. As amostras dos sítios uterinos de desenvolvimento embrionários coletados foram processados para obtenção de criocortes destinados às reações citoquímicas, imunocitoquímicas e hibridização in situ, e homogeneizados teciduais para extração do RNAm ou proteínas. Conforme esperado, os resultados da citoquímica com lectina DBA e imunocitoquímica de perforina comprovam a ausência de células uNK nos animais IL15-/- e IL15-/-/PLPA-/-, enquanto nos animais PLPA-/-, a incidência das células uNK perforina positivas não difere dos CD1 em normóxia ou hipóxia. A concentração protéica de VEGF e dos genes das isoformas VEGFA, VEGFB e VEGFC, assim como do IFN? e das isoformas iNOS e eNOS, o do TNF? e seus receptores TNFR1 e TNFR2 não apresentaram variações em suas concentrações ou níveis de expressões com padrões definidas de regulação negativa ou positiva entre os animais avaliados. Contudo a imunocitoquímica demonstrou redução de marcação de células endoteliais endoglinpositivas no endométrio e aumento no potencial invasivo de células trofoblásticas TROMA-I positivas dos animais IL15-/-. O conjunto destes resultados confirma que a ausência das células uNK afeta a vascularização normal do endométrio, a qual pode resultar em perdas gestacionais e induz a hipertrofia placentária, sem a participação direta da atividade citotóxica destas células. Comprovam também que os mecanismos de controle da expressão de fatores angiogênicos no útero gestante são multifatoriais, não sendo dependente de uma via única como o da PLPA/VEGF, ou exclusivamente das células uNK como fontes de fatores que modulam a angiogênese na interface maternofetal do útero gestante

Abstract: A gradual process of remodeling of uterine vasculature precedes placentation in humans and rodents to provide adequate blood supply in maternal-fetal interface, where NK cells producing cytokines like growth factor (VEGF) and IFN'gama' and free radical as nitric oxide (NO). Regulation of...

Abstract: A gradual process of remodeling of uterine vasculature precedes placentation in humans and rodents to provide adequate blood supply in maternal-fetal interface, where NK cells producing cytokines like growth factor (VEGF) and IFN'gama' and free radical as nitric oxide (NO). Regulation of this uNK cells activity seems to be under influence of exogenous and endogenous factors such as hypoxia as paracrine effects of prolactin-like protein-A (PLPA). Nevertheless, how these mechanisms are integrated in the control of maternal-fetal interface angiogenesis and vasculogenesis involving uNK cells are not fully understood. In this study, we investigated experimentally the uNK cells response related to the mechanisms of regulation of angiogenic factor under hypoxia influence in pre-placental period. Thus, we evaluated genetically modified mice and CD1-IL15-/-, PLPA-/- and IL15-/- /PLPA-/-pregnant on the 8th day of gestation (dg), maintained in hypoxia (420Torr-11%O2) for 48h. When compared to the control animals in normoxia (760Torr-21%O2) the amount of abnormal embryo developing sites showed statistically significant increase under hypoxia in CD1 animals, but this rate was substantially higher in the PLPA and IL15 gene depleted animals. Uterine samples were processed to obtain cryosection for cytochemical, immunocytochemical and in situ hybridization reactions and extraction of mRNA or protein for PCR or ELISA reactions, respectively. As expected, the results of cytochemistry and immunocitochemistry with DBA lectin and perforin prove the absence of uNK cells in IL15-/- and IL15-/-/PLPA-/-animals, while in PLPA-/-animals, the incidence of uNK cells perforinpositive did not differ from CD1 animlas in normoxia or hypoxia. The concentration of protein VEGF and the gene isoforms expression of VEGF (A, B and C), as well as, IFN?, iNOS and eNOS, TNF? and their receptors TNFR1 and TNFR2 did not show constancy in the pattern of variations. However, the immunocytochemistry showed reduced staining of endoglin-positive endothelial cells in the endometrium and increase in invasive potential of trophoblast cells by TROMA-I positive in IL15-/- animals. This set of results confirms that the absence of uNK cells affects the normal vasculature of the endometrium which may increased intrauterine growth restriction (IUGR) or pregnancy failure rates and induces placental hypertrophy. This abnormality at the maternal-fetal interface does not seems to be involves direct participation of cytotoxic activity of uNK cells. Furthemore, the control mechanisms of angiogenic factors expression in the pregnant uterus are multifactorial rather than dependent of a single pathway like the PLP-A/VEGF, or limited to uNK cells as a source of factors that modulate angiogenesis in the maternal-fetal interface of pregnant uterus