Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Agustine Gentile

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A transcrição é um evento crucial para a expressão gênica, sendo que a RNA polimerase II tem um papel destacado: são suas subunidades que interagem entre si e com os fatores de transcrição (TFs), formando um complexo que sintetiza o transcrito primário a partir da molécula de DNA. Entender...

Resumo: A transcrição é um evento crucial para a expressão gênica, sendo que a RNA polimerase II tem um papel destacado: são suas subunidades que interagem entre si e com os fatores de transcrição (TFs), formando um complexo que sintetiza o transcrito primário a partir da molécula de DNA. Entender como as subunidades funcionam e interagem entre si e com os TFs é um ponto fundamental para entender as bases da expressão gênica. Uma subunidade intrigante é a quarta maior subunidade, Rpb4, que juntamente com a Rpb7, a sétima maior subunidade, forma um heterodímero localizado em uma região à parte do core enzimático. Em situações de crescimento, Rpb4 encontra-se pouco associada com Rpb7. Porém, em situações de estresse a ligação das subunidades é de suma importância para a viabilidade celular. Esta tese faz a primeira caracterização do gene ScRpb4 de cana-de-açúcar, que codifica uma proteína homóloga à proteína correspondente à quarta maior subunidade da RNA Pol II de plantas. A proteína ScRpb4 foi expressa em Eschericchia coli e os resultados indicam que os maiores níveis foram observados com a construção baseada em pET-28a à 37 °C, induzidas por 4 horas com IPTG. A expressão do gene ScRpb4 foi uniforme em diferentes tecidos e condições, possuindo um ligeiro aumento da expressão na folha imatura, gema lateral, raiz e flor. Na hibridização in situ verificou-se que os transcritos foram encontrados na zona periférica do sistema vascular de folhas e no meristema apical das inflorescências, mostrando que ScRpb4 e expresso em tecidos imaturos com ativa divisão celular. A localização subcelular revelou que ScRpb4 está presente tanto no núcleo quanto no citoplasma, fato similar ao previamente reportado em leveduras. Todos os resultados encontrados estão de acordo com o provável papel de Rpb4 como parte da maquinaria transcricional, e trazem novos dados para essa subunidade em plantas

Abstract: Transcription is a crucial event for gene expression, whereas RNA Polymerase II plays an important role: its subunits interacts with each other and with the transcription factors (TFs) form a complex that synthesizes the primary transcript from the DNA molecule. Understanding how the...

Abstract: Transcription is a crucial event for gene expression, whereas RNA Polymerase II plays an important role: its subunits interacts with each other and with the transcription factors (TFs) form a complex that synthesizes the primary transcript from the DNA molecule. Understanding how the subunits work and interact among themselves and with the TFs is a key point to understand the basis of gene expression. An interesting subunit is the fourth largest subunit, Rpb4, which together with Rpb7, the seventh largest subunit, forms a heterodimer located away from the enzymatic core. In yeast, in situations of optimal conditions, Rpb4 is often associated with Rpb7, but in non­optimal conditions, the association of the subunits is critical for cell viability. Our work does the first characterization of the ScRpb4 gene from sugarcane, which encodes a homologous protein to the proteins corresponding to the fourth largest subunit of the RNA Polymerase II from plants. The ScRpb4 protein was expressed in Eschericchia coli and results indicate that the highest levels of expression was observed with the construction based on pET-28a at 37 °C, induced with IPfG for 4 hours. ScRpb4 gene expression was uniform in different tissues and conditions, with a slightly higher expression in immature leaf, lateral bud, root and flowers. In situ hybridization showed that the ScRpb4 transcripts were found at the periphery of the vascular system in leaves and in the apical meristem of inflorescence, showing that ScRpb4 is expressed in immature tissues with active cell division. The subcellular localization revealed that ScRpb4 functions in nucleus and cytoplasm, similarly to previous reports found in yeast. All the results found are in agreement with the alleged role of the ScRpb4 as a part of the transcriptional machine and provide new data of this subunit in plants