Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans e uma bacteria quimiolitotrófica, Gram-negativa e acidofílica que exerce um importante papel no processo de biolixiviação. O processo de biolixiviação e afetado por intempéries como variações na temperatura e na composição de nutrientes e, entender os...

Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans e uma bacteria quimiolitotrófica, Gram-negativa e acidofílica que exerce um importante papel no processo de biolixiviação. O processo de biolixiviação e afetado por intempéries como variações na temperatura e na composição de nutrientes e, entender os mecanismos que A. ferrooxidans dispõe para sobreviver em ambientes extremos e de suma importância para melhorar o seu emprego no processo de biolixiviação. Neste trabalho foi estudada a resposta de A. ferrooxidans ao aumento da temperatura e a privação de fosfato. Para tanto, foram utilizadas técnicas baseadas em microscopia, espectroscopia no infravermelho, ferramentas proteômicas, PCR quantitativo e bioinformática. Pela microscopia eletrônica de varredura, verificou-se o alongamento das células de A. ferrooxidans, e a espectroscopia no infravermelho (FTIR) mostrou alterações em números de ondas entre 850 e 1275 cm-1, referentes a carboidratos, fosfolipídios e fosfoproteínas. A abordagem proteômica utilizada, uma combinação de eletroforese de duas dimensões e espectrometria de massas, identificou 44 proteínas diferencialmente expressas e pertencentes a 11 categorias funcionais. Dentre as proteínas com expressão aumentada foram identificadas algumas de resposta ao choque térmico. A técnica de PCR quantitativo em tempo real foi utilizada para avaliar o padrão de Expressão de genes do choque térmico e de outros genes que codificam proteínas pertencentes a diversas categorias funcionais em A. ferrooxidans. Para tanto, A. ferrooxidans foi cultivada a 40?C ate 50% de oxidação dos íons ferrosos (aproximadamente metade fase logarítmica) e também foi submetida a um choque térmico em diferentes tempos e na mesma temperatura. Os resultados obtidos mostraram que o padrão de expressão da maioria dos genes analisados foi afetado apos o choque térmico. Contudo, o crescimento a 40?C pouco afetou a expressão gênica, com exceção de alguns genes relacionados com o transporte de ferro, os quais foram consideravelmente reprimidos. Analises in silico para predição de sítios de ligação do fator sigma 32 da RNA polimerase nos genes afetados pelo aumento da temperatura indicaram que 15 do total de genes analisados possivelmente estão sob a regulação deste fator. Adicionalmente, analises da filogenia das sequências de aminoácidos de três "small heat shock proteins" (AFE_1437, AFE_1009 e AFE_2172) revelou que elas são, possivelmente, proteínas nao-paralogas. Estudos estruturais baseados em modelagem molecular por homologia indicaram que as proteínas AFE_1437, AFE_1009 e AFE_2172 possuem um domínio ?-cristalino com características estruturais semelhantes. Contudo, a proteína codificada por AFE_2172 apresenta uma região C-terminal bastante curta. Os resultados obtidos com este trabalho mostram que A. ferrooxidans possui um conjunto de respostas ao estresse muito bem elaborado, enfatizando seu potencial para uso biotecnológico

Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans is a chemolithoautotrophic, Gram negative, acidophilic bacterium which plays an important role in metal bioleaching. During bioleaching, cells are subjected to changes in growth temperature and nutrient starvation, thus understanding the mechanisms used for...

Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans is a chemolithoautotrophic, Gram negative, acidophilic bacterium which plays an important role in metal bioleaching. During bioleaching, cells are subjected to changes in growth temperature and nutrient starvation, thus understanding the mechanisms used for their survival in such harsh environments could help to improve Acidithiobacillus's efficacy on such processes. This study presents the effects of heat and phosphate starvation on A. ferrooxidans physiology, analysed using microscopy, infrared spectroscopy, proteomic tools, quantitative PCR and bioinformatics. Scanning electron microscopy results showed that under the tested stress conditions A. ferrooxidans cells became elongated, and the Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) analysis showed alterations in wavenumbers between 850 and 1275 cm-1, which are related to carbohydrates, phospholipids and phosphoproteins. Proteomic analyses, such as 2-DE and tandem mass spectrometry, identified 44 differentially expressed protein spots, the identified proteins belonging to 11 different functional categories. The up-regulated proteins were mainly from the protein fate category. Real time quantitative PCR was employed to analyze changes in the expression patterns of heat shock genes, as well as many other genes encoding proteins related to several functional categories in A. ferrooxidans. Cells were submitted to long-term growth and to heat shock, both at 40°C. The results evidenced that heat shock affected the expression levels of most genes while long-term growth at 40°C caused minimal changes in gene expression patterns - with exception of some iron transport related genes, which were strongly down-regulated. Further bioinformatic analysis indicated a putative transcriptional regulation, by the ?32 factor, for 15 of the 34 heat-affected genes. In addition, phylogenetic analysis of some small heat shock proteins (AFE_1437, AFE_1009 e AFE_2172) showed that sHSPs from A. ferrooxidans are possible non paralogous proteins. Homology molecular modeling structure studies indicated that the proteins encoded by AFE_1437, AFE_1009, and AFE_2172 have conserved ?-crystallin domains. However, the model for AFE_2172 showed a very short C-terminus. These results evidence that A. ferrooxidans has an efficient range of stress-responses, which explains its ability for biotechnological purposes