Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O enovelamento protéico é essencial para a correta função biológica das proteínas. A existência de um ambiente com alta concentração dos mais diferentes tipos de moléculas, dentro da célula, e de diversos tipos de situações de estresse, podem agir induzindo a formação de espécies...

Resumo: O enovelamento protéico é essencial para a correta função biológica das proteínas. A existência de um ambiente com alta concentração dos mais diferentes tipos de moléculas, dentro da célula, e de diversos tipos de situações de estresse, podem agir induzindo a formação de espécies improdutivas na via de enovelamento, como proteínas mal enoveladas e/ou até mesmo agregados protéicos. Para controlar estes eventos, há a maquinaria de chaperonas moleculares, que tem por objetivo garantir a homeostase protéica celular. As chaperonas moleculares são capazes de ligar e estabilizar um polipeptídio, mas sem contribuir com informações para a sua conformação final. Dentro desta maquinaria, o sistema Hsp70 tem um papel central, sendo responsável por receber proteínas desenoveladas ou mal enoveladas de outras chaperonas, podendo auxiliar no reenovelamento e direcionamento para outras chaperonas moleculares ou para degradação. A Hsp70 é regulada por co-chaperonas, como a Hsp40, que é responsável pela entrega de proteínas clientes à Hsp70 e pelo estímulo da atividade ATPase, essencial para a funcionalidade da Hsp70. Este trabalho apresenta a caracterização de uma Hsp40 tipo I de cana-de-açúcar, nomeada SHsp40, e o estudo de uma Hsp40 tipo II de levedura e seus mutantes, a fim de entender a relação estrutura-função destas proteínas. A SHsp40 foi expressa em E. coli, purificada e obtida enovelada, como verificado por dicroísmo circular. Além disso, a SHsp40 apresentou atividade chaperona em experimentos de proteção ao substrato desenovelado e se comportou como um dímero alongado em solução, como mostrado por SEC-MALS e pela determinação do fator de Perrin. Experimentos de desenovelamento térmico monitorado pelo sinal de CD a 222 nm revelaram que a SHsp40 possui pelo menos um intermediário, e a fluorescência de tioflavina T e bis-ANS mostraram que este intermediário é rico em folhas ? e parcialmente desenovelado, características de espécies na via de formação de fibrilas. A SHsp40 agregada foi examinada por microscopia eletrônica de varredura, que comprovou sua capacidade de formar de fibrilas. Este trabalho também contribuiu para o estudo de uma Hsp40 tipo II de levedura, Sis1, e seus mutantes de deleção, Sis1?124-174 e Sis1?121-257. Ensaios de fluorescência estática do triptofano, fotoapagamento e anisotropia mostraram que a deleção do domínio G/M não afetou a estrutura e hidrodinâmica de Sis1?124-174 em relação à proteína selvagem. Estudos de estabilidade destas proteínas, realizado anteriormente em nosso grupo de pesquisa e complementado neste trabalho pelo uso da técnica de SEC-MALS, mostrou que Sis1 e Sis1?124-174 foram mais estáveis que Sis1?121-257, mutante que o domínio G/M e subdomínio CTDI estão ausentes

Abstract: Correct protein folding is essential for proper protein biological function. There is a crowded environment and many types of molecules inside the cell and a variety of external stresses can act inducing unproductive species, as unfolded and/or misfolded proteins and even protein...

Abstract: Correct protein folding is essential for proper protein biological function. There is a crowded environment and many types of molecules inside the cell and a variety of external stresses can act inducing unproductive species, as unfolded and/or misfolded proteins and even protein aggregates. To control these undesired events and ensures the protein homeostasis there is a molecular chaperone machinery. Molecular chaperones are able to bind and stabilize polypeptides but with no contributions for their final conformations. Inside this machinery, the Hsp70 system has a central role and is responsible to receive unfolded or misfolded proteins from other chaperones, helping in protein refolding and delivering the clients to other chaperones and even protein targeting for degradation. Hsp70 is regulated by its co-chaperones, such as Hsp40, which is responsible to client proteins deliver to Hsp70 and stimulation of its ATPase activity, essential processes for Hsp70 function. This work presents a sugarcane type I Hsp40 characterization, named SHsp40, and studies of an yeast type II Hsp40 and its mutants in order to understand the structure-function relationship of these proteins. The SHsp40 was expressed in E. coli, purified and obtained folded, as verified by circular dichroism. Furthermore, SHsp40 presented chaperone activity in unfolded substrate protection experiments and behaved as an elongated dimer in solution, as shown by SEC-MALS and estimated by Perrin factor. Thermal-induced unfolding experiments monitored by CD signal at 222 nm revealed that SHsp40 has at least one intermediate which is populated and tioflavin T and bis-ANS fluorescence showed that this intermediate is ? sheet-rich and partially folded, such as intermediate species in the fibril formation pathway. The aggregated SHsp40 was examined by scanning electron microscopy, wich proved its ability to fibril formation. This work also contributed for the study of an yeast type II Hsp40, Sis1, and its deletion mutants, Sis1?124-174 and Sis1?121-257. Steady-state tryptophan fluorescence, quenching and anisotropy assays showed that the G/M domain deletion did not affect the structure and hydrodynamic properties of Sis1?124-174 in relation to the wild type protein. Stability studies of these proteins, previously performed in our research group and complemented in this work by using the SEC-MALS technique, showed that Sis1 and Sis1?124-174 were more stable than Sis1?121-257, a mutant with the G/M domain and CTDI subdomain absents