Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Ricardo Aparício

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Diversas pesquisas buscam candidatos para o controle alternativo de pragas agrícolas, uma vez conhecidos os malefícios oriundos do emprego de inseticidas químicos nas lavouras. Neste trabalho, um inibidor de tripsina isolado de sementes de Entada acaciifolia (Mimosoideae) - (EATI) foi...

Resumo: Diversas pesquisas buscam candidatos para o controle alternativo de pragas agrícolas, uma vez conhecidos os malefícios oriundos do emprego de inseticidas químicos nas lavouras. Neste trabalho, um inibidor de tripsina isolado de sementes de Entada acaciifolia (Mimosoideae) - (EATI) foi purificado e caracterizado sob o ponto de vista funcional e estrutural. O inibidor mostrou-se estável a variações térmicas e de pH, alem de apresentar sua atividade inibitória inalterada tanto na forma oxidada quanto na forma reduzida com 100 mM de DTT. Quando submetido a cromatografia liquida de alta eficiência em coluna C-18, EATI foi resolvido em 4 picos, indicando a presença de 4 isoformas, sendo que a isoforma majoritária apresentou uma massa acurada de 19.725 Daltons, revelada através de espectrometria de massa MALDI-TOF. Outras características como a estequiometria de inibição, a constante de inibição (Ki), a analise da composição global de aminoácidos e o sequenciamento N-terminal permitiram classificar EATI como membro da família Kunitz de inibidores de serinoprotease. Estudos de dicroísmo circular revelaram um alto conteúdo de fohas-? e estruturas não ordenadas alem da aparente ausência de ?-helices, padrão comum a esta classe de proteínas. A incubação em 1 mM de DTT resultou em perturbações em sua cadeia polipeptídica, corroborando os ensaios in vitro. EATI foi resistente a desnaturação por uréia, característica relatada para outros inibidores vegetais. O inibidor apresentou uma interessante atividade inibitória in vitro contra as proteases de diversos insetos-praga. De acordo com estes resultados, apontamos EATI como uma ferramenta promissora no combate a pragas agrícolas

Abstract: Several studies seeking alternative candidates for the control of agricultural pests, once known harm from the use of chemical insecticides in crops. In this work, a trypsin inhibitor isolated from Entada acaciifolia seeds (Mimosoideae) - (EATI) was purified and characterized from the...

Abstract: Several studies seeking alternative candidates for the control of agricultural pests, once known harm from the use of chemical insecticides in crops. In this work, a trypsin inhibitor isolated from Entada acaciifolia seeds (Mimosoideae) - (EATI) was purified and characterized from the point of view unctional and structural. The inhibitor was stable to thermal heat and pH range, in addition to its inhibitory activity unchanged in both the oxidized and in reduced form with 100 mM DTT. When subjected to high performance liquid chromatography on C-18 column, EATI was resolved in four peaks, indicating the presence of four isoforms, with the major isoform showing an accurate mass of 19,725 Daltons, as revealed by MALDI-TOF mass spectrometry. Other characteristic such as stoichiometry of inhibition, the dissociation constant (Ki), the analysis of global amino acid composition and N-terminal sequencing allowed to classify EATI as member of the Kunitz family of serine protease inhibitors. Circular dichroism studies revealed a high content of ?- sheets and unordered structures beyond the apparent absence of ?-helix, typical of this class of proteins. Incubation in 1 mM DTT resulted in small perturbations in their polypeptide chain, corroborate the in vitro assays. EATI was resistant to denaturation by urea, a characteristic reported for other plant inhibitors. The inhibitor presented an interesting inhibitory activity in vitro against the proteases of several insect pests. According to these results, we focused EATI as a promising tool in the fight against agricultural pests