Orientador: Roger Frigério Castilho

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Medicina

Resumo: É proposto que a neurodegeneração que ocorre na doença de Alzheimer seja decorrente do acúmulo intra e extracelular de peptídeos beta-amilóide (A?), num processo que envolve comprometimento do metabolismo oxidativo mitocondrial. O objetivo do presente trabalho foi investigar e comparar os...

Resumo: É proposto que a neurodegeneração que ocorre na doença de Alzheimer seja decorrente do acúmulo intra e extracelular de peptídeos beta-amilóide (A?), num processo que envolve comprometimento do metabolismo oxidativo mitocondrial. O objetivo do presente trabalho foi investigar e comparar os efeitos das formas agregada (oligomérica e fibrilar) de A?42 e da forma não agregada (monomérica) de A?40 na função mitocondrial. Mostrou-se, em eletroforese em gel de poliacrilamida, que o protocolo de preparo das formas agregadas e não agregada dos peptídeos estava de acordo com o perfil de agregação descrito na literatura. Estimou-se o consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos, na presença ou ausência de peptídeos A?, utilizando como substratos malato e glutamato. Não houve efeito significativo de 12 µM dos peptídeos A? na respiração mitocondrial em estado de repouso (estado 4) ou durante a fosforilação oxidativa (estado 3), porém observou-se um estímulo do estado 4 quando os peptídeos foram utilizados na concentração de 24 µM. O estímulo mais significativo na respiração mitocondrial em estado 4 foi observado com o A?40 (39%), quando comparado aos estímulos observados na presença das formas oligomérica (31%) e fibrilar (29%) de A?42. O maior efeito de A?40 pode ser devido a sua característica hidrofóbica, permitindo sua maior interação na membrana mitocondrial. A partir destes resultados, avaliou-se o efeito de A?40 (24 µM) na razão ADP/O, sendo observada uma redução de 11% neste parâmetro. Ao se comparar o efeito de A?40 (24 µM) em mitocôndrias cerebrais sinápticas e não-sinápticas, observou-se que as organelas sinápticas foram mais suscetíveis ao peptídeo, apresentando um estímulo do estado 4 de 38%, enquanto que as não-sinápticas apresentaram um estímulo de apenas 15%. Quando o meio de reação contendo A?40 foi ultrafiltrado (corte > 3 kDa) o estímulo da respiração mitocondrial foi abolido. Observou-se uma redução de 71% na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no estado 4 da respiração na presença de A?40 (24 µM) e quando o peptídeo A?42 oligomérico foi testado a redução foi de 29%. A redução observada na produção de EROs pode ser explicada pelo desacoplamento parcial da respiração mitocondrial provocada pelos peptídeos A?. Não houve diferença na capacidade de retenção de Ca2+ por mitocôndrias na presença de peptídeos A?. Por fim, verificou-se que o peptídeo A?40 leva a uma diminuição da fluidez das membranas mitocondriais. Conclui-se que peptídeos A? podem ser diretamente tóxicos a mitocôndrias neuronais, o que pode ter um papel na fisiopatologia da doença de Alzheimer.

Abstract: Neurodegeneration in Alzheimer¿s disease involves intra- and extracellular accumulation of betaamyloid peptides (A?) in a process leading to impairment of mitochondrial oxidative metabolism. The aim of the present study was to investigate and compare the effects of the aggregated forms of...

Abstract: Neurodegeneration in Alzheimer¿s disease involves intra- and extracellular accumulation of betaamyloid peptides (A?) in a process leading to impairment of mitochondrial oxidative metabolism. The aim of the present study was to investigate and compare the effects of the aggregated forms of A?42 (oligomers and fibrils) and the unaggregated form of A?40 (monomers) on mitochondrial function. Polyacrylamide gel electrophoresis was run as a control and showed that our preparation protocols generated aggregated and unaggregated forms of the peptides in agreement with the patterns reported in the literature. Oxygen consumption by isolated rat brain mitochondria was measured in the presence or absence of A? peptides, using malate and glutamate as substrates. A? peptides at 12 µM did not have a significant effect on respiratory state 4 (resting respiration) or state 3 (ADP-stimulated respiration). However, a higher state 4 respiration was observed when the peptides were used at a concentration of 24 µM. The most significant increase in mitochondrial state 4 respiration was observed with A?40 (39%) followed by A?42 oligomers (31%) and fibrils (29%). The bigger effect found with A?40 may be due to its hydrophobicity, which enables greater interaction with the inner mitochondrial membrane. We then evaluated the effect of A?40 (24 µM) on the ADP/O ratio and found an 11% reduction in this parameter. Comparing the effect of A?40 (24 µM) on synaptic and non-synaptic mitochondria, we observed that the former were more susceptible to A?40, with an increase in the state 4 respiration of 38%, while the latter showed only a 15% increase. After ultrafiltration (3 kDa cutoff) of the reaction medium containing A?40, no effect on mitochondrial respiration was observed. We found 71% and 29% inhibition of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production in state 4 in the presence of the A?40 monomer and A?42 oligomer at 24 µM, respectively. The inhibition of ROS production may be explained by the partial mitochondrial respiratory uncoupling caused by the A? peptides. These peptides were not observed to have any effect on mitochondrial Ca2+ uptake or retention. Lastly, our results indicated that A?40 leads to a decrease in mitochondrial membrane fluidity. We conclude that A? peptides may be directly toxic to neuronal mitochondria, this may play an important role in the pathophysiology of Alzheimer¿s disease.