Orientador: Marcelo Menossi Teixeira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A cultura da cana-de-açúcar (Saccharum spp) está entre as mais importantes do Brasil, tendo o setor sucroalcooleiro grande importância econômica no país devido ao crescente consumo de álcool e açúcar. A fase de maturação no desenvolvimento da cana-de-açúcar é especialmente interessante, pois...

Resumo: A cultura da cana-de-açúcar (Saccharum spp) está entre as mais importantes do Brasil, tendo o setor sucroalcooleiro grande importância econômica no país devido ao crescente consumo de álcool e açúcar. A fase de maturação no desenvolvimento da cana-de-açúcar é especialmente interessante, pois está diretamente relacionada com o teor de sacarose. O hormônio etileno está envolvido em muitos aspectos do ciclo de vida da planta, incluindo a maturação. Como primeira parte deste projeto, o objetivo foi avaliar a relação entre etileno e maturação de cana-de-açúcar pela caracterização da expressão dos genes que codificam as isoformas da enzima ACC sintase, responsável por uma das vias da biossíntese desse hormônio. Assim, dois genes (Scacs1 e Scacs2) que codificam para a enzima ACC sintase foram identificados no projeto SUCEST e caracterizados. Nossos resultados de localização subcelular confirmaram estudos anteriores sobre a localização citoplasmática das proteínas ACS. Todavia, nós identificamos por análise in silico a presença de um peptídeo sinal na região N-terminal da proteína ScACS2. Ensaios de duplo-híbrido com bibliotecas de cDNAs a partir de tecidos de folha +1 e entrenó 5, nos revelaram novas interações putativas com a proteína ScACS2, sendo uma delas, a proteína denominada sinaptotagmina envolvida no mecanismo de reparo da membrana celular. Ao contrário do que foi observado em Arabidopsis, nossos resultados de heterodimerização não identificaram uma interação entre as isoformas de cana-de-açúcar. Análise de expressão por PCR quantitativo em duas variedades contrastantes ao teor de sacarose, identificaram uma maior expressão nos entrenós madurados quando comparados aos entrenós jovens para os dois genes ACS. Em uma estudo in situ da expressão, o gene Scacs1 apresentou uma expressão nas células do parenquima e nas células da bainha do feixe vascular, entretanto, não mostrou expressão nos feixes vasculares. Por outro lado, o gene Scacs2 apresentou expressão constitutiva nos diferentes tipos celulares e, inclusive, nos feixes vasculares. Os resultados apresentados nesse trabalho, abrem novas perspectivas e perguntas para os diversos mecanismos fisiológicos e celulares realizados pelo hormônio etileno nas plantas. Todavia, uma prática comum antes da colheita da cana é a aplicação de precursores do hormônio etileno, como o etefon (ácido 2-cloroetil fosfônico) para acelerar o amadurecimento final das plantas, inibir o florescimento e consequentemente aumentar o teor de sacarose. Assim, a manipulação da biossíntese desse hormônio tem o potencial para aumentar a produtividade em cana. Desta forma, um segundo objetivo deste projeto foi desenvolver uma estratégia para promover o amadurecimento controlado da cana-de-açúcar no final da safra, usando o etanol em substituição aos análogos químicos do etileno. Para tal, foi avaliado o uso de um promotor ativado por etanol (sistema de expressão alc de Aspergillus nidulans) controlando a expressão do gene que codifica a ACC sintase, enzima chave na biossíntese de etileno. Nossos resultados foram condizentes com o esperado, mostrando claramente um aumento na produção do hormônio etileno quando plantas transgênicas de tabaco foram induzidas por spray foliar com 5% (v/v) de etanol. Esses resultados demonstram a possível utilização de ferramentas biotecnológicas no controle da expressão de genes envolvidos em características agrícolas interessantes, tais como na cultura de cana-de-açúcar.

Abstract: Sugarcane crop (Saccharum spp) is among the most important of Brazil, due to its economic importance in the country with the increasingly consume of its by-products such as the ethanol and sugar. Throughout development of the sugarcane, the maturation phase is especially interesting,...

Abstract: Sugarcane crop (Saccharum spp) is among the most important of Brazil, due to its economic importance in the country with the increasingly consume of its by-products such as the ethanol and sugar. Throughout development of the sugarcane, the maturation phase is especially interesting, whereas it is highly related to sucrose accumulate. The ethylene hormone is involved in several physiological processes of plants, including the maturation. As first part of this project, the goal was evaluated the correlation between ethylene hormone and sugarcane maturation through characterization of the genes expression encoded ACS enzymes, involved in biosynthesis pathway of this hormone. Thus, two genes (Scacs1 and Scacs2), which encoding the ACS enzyme, were identified in SUCEST project and characterized. Our results of subcellular localization confirmed previous studies regarding to cytoplasmic localization of ACS proteins. Nonetheless, we identify through in silico analyses the presence of a signal peptide in the N-terminal region of the ScACS2 protein. Yeast two-hybrid assay using cDNAs libraries from leaf +1 and internode 5 tissues, revealed putative interactions with the ScACS2 protein, being one of them, a protein called plant synaptotagmin involved in the mechanism of cell membrane repair. Different from Arabidopsis, our results about heterodimerization did not identify an interaction between sugarcane ACS isoenzymes. Expression analyses of quantitative PCR in two sugarcane varieties contrasting to Brix content presented a higher expression of ACS genes in mature internodes than young internodes. In situ analyses for Scacs1 gene showed an expression in parenchyma cells and bundles sheath, however, none expression was observed in vascular bundles. On the other hand, the Scacs2 gene presented an ubiquitous expression in the different cell types and, including in vascular bundles. Our results presented in this work, open further perspectives and issues about the underlying mechanisms by ethylene hormone in plants. Nevertheless, a common practice before harvest of sugarcane is the application of precursors of ethylene hormone, such as ethephon (2-chloroethyl- dioxido-oxophosphorane) to accelerate plants ripening, delay opening of the inflorescence and to increase sucrose accumulate. As a result, the manipulation of biosynthetic pathway of this hormone is a potential tool to increase the productivity in sugarcane. Thus, other goal of this work was develop a strategy to promote a controlled ripening of sugarcane at the end of harvest, using the inductor ethanol instead of ethylene precursor. To achieve this goal, an ethanol-inducible system based on alc switch of the ascomycete fungus Aspergillus nidulans were evaluated controlling gene expression of ACS and consequently the production of the ethylene hormone. Our results were consistent with the expected, showing clearly an increase in the production of ethylene hormone when transgenic tobacco plants were induced for the leaf spray with 5% (v/v) ethanol. This result shows the possible utilization of biotechnology tools in the control of gene expression involved in important agricultural traits, such as in the sugarcane culture.