Orientadores: Francisco Humberto Nociti Junior, Karina Gonzales Silvério Ruiz

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: A formação deficiente do cemento acelular sobre a raiz dentinária de pacientes com hipofosfatasia (HPP) elucida a importância da expressão local da enzima fosfatase alcalina (TNAP) durante a cementogênese. Os objetivos desses estudos foram: i) apresentar dois casos clínicos de perda...

Resumo: A formação deficiente do cemento acelular sobre a raiz dentinária de pacientes com hipofosfatasia (HPP) elucida a importância da expressão local da enzima fosfatase alcalina (TNAP) durante a cementogênese. Os objetivos desses estudos foram: i) apresentar dois casos clínicos de perda prematura de dentes decíduos diagnosticados como odonto-HPP; ii) caracterizar diferencialmente o perfil de expressão gênica de células da polpa e ligamento periodontal em indivíduos saudáveis e com HPP em relação a genes envolvidos com o metabolismo do fosfato inorgânico (Pi). iii) caracterizar o reparo e regeneração dos tecidos periodontais em modelo de fenestração periodontal realizado em camundongos com bloqueio do gene da proteína de anquilose (Ank KO). Métodos: i) Pacientes apresentaram esfoliação precoce dos decíduos aos dois anos de idade, mantendo-se em tratamento odontológico rigoroso. Ambos apresentaram baixos níveis séricos de fosfatase alcalina (ALP), porém sem anormalidade esquelética chegando-se ao diagnóstico de odonto-HPP; ii) Análise da expressão de genes associados à homeostasia entre fosfato e pirofosfato (Pi/PPi) foi realizada em tecidos da polpa e ligamento periodontal (PDL) de indivíduos saudáveis. Cultura de células primárias da polpa e PDL obtidas de pacientes saudáveis e com HPP foram estabelecidas para os ensaios de mineralização e expressão gênica; iii) Defeitos de fenestração periodontal (2mm/1mm/0,5mm) foram criados na vestibular de molares mandibulares de camundongos Ank KO e wild-type (WT). Após 15 e 30 dias das cirurgias, as mandíbulas foram coletadas para análise histológica, histomorfometria, avaliação in vivo com marcadores fluorescentes, e imunohitoquímica para proteínas da matriz extracelular. Resultados: i) Cuidados odontopediátricos e terapia periodontal de suporte foram realizados durante 19 anos com o objetivo de prevenir/adiar possíveis perdas de dentes permanentes; ii) Nos tecidos saudáveis, PDL manteve maior e significativa expressão basal para os genes reguladores chaves do PPi quando comparado com a polpa, como fosfatase alcalina (Alpl), proteína de anquilose pregressiva (Ank), e glicoproteína 1 (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 - Enpp1). In vitro, embora as alterações mais dramáticas fossem encontradas nas células do PDL, tanto as células HPP PDL como HPP-polpa exibiram significativamente baixa atividade de ALP, menor mineralização e expressões reduzidas dos genes associados com a mineralização e regulação do Pi/PPi, comparado ao controle; iii) Grande quantidade de novo cemento foi observada nos camundongos Ank KO após 15 e 30 dias da cirurgia. (p<0,05). Os marcadores fluorescentes indicaram maior atividade de deposição cementária nas áreas dos defeitos nos Ank KO vs. WT. Durante os períodos de 15 e 30 dias de cicatrização, regeneração do cemento e células associadas nos Ank KO recapitularam o padrão de expressão gênica mapeada durante o desenvolvimento, incluindo expressão limitada de BSP e forte OPN e DMP1 na matriz cementária, bem como elevada expressão de NPP1 nos cementoblastos. Conclusões: Dentro dos limites desse estudo, podemos concluir que: i) a perda prematura de dentes decíduos na ausência de desordens esqueléticas pode servir como um sinal inicial crítico para o diagnóstico de odonto-HPP e outros subtipos; ii) os dados sugerem que há uma diferença importante no comportamento in vitro entre as células controle e HPP, incluindo a expressão basal dos genes relacionados ao cemento bem como suas capacidades de promoverem a formação de minerais; iii) Dentro dos limites do estudo, os achados sugerem que níveis reduzidos de PPi local pode promover um aumento da regeneração do cemento. Portanto, a modulação entre Pi/PPi pode ser uma potente abordagem terapêutica para alcançar melhoras na regeneração do cemento.

Abstract: The defective formation of acellular cementum along the tooth root in patients with hypophosphatasia (HPP) have been highlighted the importance of local expression of alkaline phosphatase enzyme (TNAP) for cementogenesis. The aims of these studies were: i) to present two clinical cases...

Abstract: The defective formation of acellular cementum along the tooth root in patients with hypophosphatasia (HPP) have been highlighted the importance of local expression of alkaline phosphatase enzyme (TNAP) for cementogenesis. The aims of these studies were: i) to present two clinical cases that premature loss of primary teeth guided to the diagnosis of odontohypophosphatasia (odonto-HPP); ii) to determine factors contributing to the divergent response of the periodontium and dentin to alterations of phosphate (Pi) metabolism; and iii) to analyze tissue repair and regeneration in a periodontal fenestration model in Ank knock-out (KO) mice. Methods: i) Patients had teeth exfoliation at 2 yearsold, and have been under maintenance visits since then. Both exhibited low levels of serum alkaline phosphatase (ALP) activity, but no additional skeletal abnormalities, prompting a diagnosis of odonto-HPP; ii) Constitutive expression of Pi/PPi-associated genes in periodontal ligament (PDL) versus pulp tissues obtained from healthy subjects were analyzed. Primary cell cultures from control and HPP-PDL and pulp tissues were established to assay mineralization and gene expression; iii) Periodontal fenestration defects (2mm/1mm/0.5mm) were created on the buccal aspects of mandibular molars in Ank KO and wild-type (WT) mice. Mandibles were harvested at 15, and 30 days postsurgery for histology, histomorphometry, evaluation of in vivo fluorochrome labeling, and immunohistochemistry (IHC) for extracellular matrix proteins. Results: i) Pediatric dental care and supportive periodontal therapy were performed during the subsequent 19 years, aimed at avoiding or delaying loss of permanent teeth. ii) In healthy tissues, PDL maintained significantly higher basal expression of key PPi regulators, liver/bone/kidney alkaline phosphatase (Alpl), progressive ankylosis protein (Ank) and ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (Enpp1), versus pulp. In vitro, although more dramatic changes were found for PDL-harvested cells, both HPP-PDL and HPP-pulp cells exhibited significantly lower alkaline phosphatase activity, mineralization, and depressed expression of genes associated with mineralization and regulation of Pi/PPi, versus control cells. iii) A greater amount of new cementum was observed for Ank KO mice at 15 and 30 days post-surgery (p<0.05). Fluorochrome labeling further indicated a higher appositional activity in the defect areas in Ank KO vs. controls. At days 15 and 30 during healing, regenerating cementum and associated cells in Ank KO recapitulated expression patterns mapped during development, including limited BSP and strong OPN and DMP1 in the cementum matrix, as well as elevated NPP1 in cementoblasts. Conclusions: Within the limits of these studies, we can conclude that: i) premature loss of deciduous teeth in absence of skeletal disorders may serve as a critical trigger sign for diagnosis of odonto- HPP or other subtypes; ii) the data suggest that there are important differences in the in vitro behavior of control versus HPP cells, including basal expression of cementum-related genes as well as their capacity to promote mineral formation; iii) these findings suggest that reduced local levels of PPi can promote increased cementum regeneration. Therefore, local modulation of Pi/PPi may be a potential therapeutic approach for achieving improved cementum regeneration.