Estabilização, concentração, purificação e aplicação da transglutaminase microbiana de Streptomyces sp. CBMAI 837
Evandro Antônio de Lima
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP L628e
[Stabilization, concentration, purification and application of microbial transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI 837]
Campinas, SP : [s.n.], 2010.
120 p.
Orientador: Hélia Harumi Sato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Resumo: A transglutaminase microbiana (MTGase; EC 2.3.2.13) é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações covalentes cruzadas entre proteínas, peptídeos e várias aminas primárias através da reação de acil transferência entre resíduos de glutamina e lisina. A incorporação de ligações...
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Resumo: A transglutaminase microbiana (MTGase; EC 2.3.2.13) é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações covalentes cruzadas entre proteínas, peptídeos e várias aminas primárias através da reação de acil transferência entre resíduos de glutamina e lisina. A incorporação de ligações covalentes cruzadas entre proteínas por ação da transglutaminase vem sendo empregada pela indústria alimentícia para modificar principalmente a textura, a viscosidade e a capacidade de formação de gel de alimentos. Este trabalho teve como principal objetivo estudar a estabilidade térmica, o efeito de inibidores e ativadores, a concentração e a purificação da transglutaminase microbiana produzida pela linhagem Streptomyces sp. CBMAI 837. No estudo da estabilidade térmica da enzima verificou-se que a transglutaminase de Streptomyces sp. CBMAI 837 é uma enzima termossensível, estável em temperaturas abaixo de 40°C e rapidamente inativada acima de 50°C. Parâmetros cinéticos e termodinâmicos da desnaturação térmica da enzima foram determinados para as seis temperaturas estudadas. Os tempos de meia-vida da enzima a 55 e 60°C foram estimados em 3,5 e 1,9 minutos, respectivamente. A influência de alguns compostos no aumento da estabilidade térmica da enzima foi investigada, sendo verificado que a adição de EDTA e KCl na concentração de 1% e de cisteína e glutationa na concentração de 0,1% aumentaram a estabilidade térmica da transglutaminase durante incubação a 45°C por 30 minutos. O efeito de compostos como etanol, ativadores e inibidores enzimáticos na atividade da MTGase de Streptomyces sp. CBMAI 837 foi estudado. O etanol na concentração de 10% (v:v) apresentou pouco efeito na atividade enzimática, enquanto que concentrações acima de 40% (v:v) provocaram rápida inativação da enzima. A MTGase foi ativada na presença de EDTA e cisteína e inativada na presença de iodoacetamida e ácido cloromercuribenzóico, sugerindo que esta é uma enzima cálcio independente com um resíduo de cisteína no sítio ativo. No estudo da concentração da MTGase foram avaliados diferentes métodos, sendo verificado que a precipitação com sulfato de amônio a 80% de saturação foi o método mais efetivo, possibilitando a concentração do sobrenadante de cultivo cerca de 4,5 vezes com rendimento de 142%. A aplicação da preparação enzimática bruta concentrada de MTGase de Streptomyces sp. CBMAI 837 em proteína texturizada de soja apresentou efeito similar ao da enzima comercial Activa® TG-BP quando aplicada nas mesmas condições. Na purificação da MTGase de Streptomyces sp. CBMAI 837 em coluna de afinidade Blue Sepharose CL-6B foram separadas 3 frações com atividade de transglutaminase (TG-BS1, TG-BS2 e TG-BS3), indicando a presença de isoenzimas. A massa molecular da MTGase presente nas frações purificadas TG-BS2 e TG-BS3 foi estimada em cerca de 35 KDa por SDS-PAGE. As três frações obtidas foram caracterizadas quanto ao pH ótimo de atividade enzimática. Foi observado que a fração parcialmente purificada TG-BS1 apresentou atividade ótima em pH 10,0 e um segundo pico de atividade em pH 6,0, enquanto as frações purificadas TG-BS2 e TG-BS3 apresentaram pH ótimo de atividade em pH 6,5 e também um segundo pico de atividade em pH 10,0
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Abstract: The microbial transglutaminase (MTGase, EC 2.3.2.13) is an enzyme capable of catalyzing the formation of covalent cross-links among proteins, peptides and various primary amines by reaction of acyl transfer between glutamine and lysine residues. The incorporation of covalent cross-links...
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Abstract: The microbial transglutaminase (MTGase, EC 2.3.2.13) is an enzyme capable of catalyzing the formation of covalent cross-links among proteins, peptides and various primary amines by reaction of acyl transfer between glutamine and lysine residues. The incorporation of covalent cross-links between proteins by the action of transglutaminase has been used by the food industry to modify especially the texture, viscosity and gel forming ability of foods. This work aimed to study the thermal stability, effect of inhibitors and activators, concentration and purification of microbial transglutaminase produced by strain Streptomyces sp. CBMAI 837. It was observed in the study of thermal stability of the enzyme that the transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI 837 is a thermosensitive enzyme, stable at temperatures below 40°C and rapidly inactivated above 50°C. Kinetic and thermodynamic parameters of thermal denaturation of the enzyme were determined for six temperatures. It was estimated that the half-life times of the enzyme at 55 and 60°C were 3.5 and 1.9 minutes, respectively. The influence of compounds to increase the thermal stability of the enzyme was investigated, and it was found that the addition of EDTA and KCl at a concentration of 1% and cysteine and glutathione at a concentration of 0.1% increased the thermal stability of transglutaminase during the incubation at 45°C for 30 minutes. The effect of compounds such as ethanol, activators and inhibitors on enzymatic activity of MTGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 was studied. The ethanol concentration 10% (v/v) had little effect on enzyme activity, while concentrations above 40% (v/v) resulted in rapid inactivation of the enzyme. The MTGase was activated in the presence of EDTA and cysteine and inactivated in the presence of iodoacetamide and chloromercuribenzoic acid, suggesting that this is a calcium independent enzyme with a cysteine residue at the active site. Different methods were evaluated in the study of the concentration of MTGase, confirming that the precipitation with ammonium sulfate at 80% saturation of the culture supernatant was the method more effective, being concentrated this enzyme about 4.5 fold with a yield of 142%. The application of crude enzyme preparation of MTGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 concentrated by ammonium sulfate in texturized soy protein showed a similar effect to the one of commercial enzyme Activa® TG-BP when applied under the same conditions. Three fractions with transglutaminase activity (TG-BS1, TG-BS2 e TG-BS3) were separated in the purification of MTGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 in column affinity Blue Sepharose CL-6B, indicating the presence of isoenzymes. The molecular mass of MTGase present in the purified fractions TG-BS2 e TG-BS3 was estimated at about 35 KDa by SDS-PAGE. The three fractions were characterized by optimum pH of enzymatic activity. It was observed that the partially purified fraction TG-BS1 showed optimal activity at pH 10.0 and a second peak of activity at pH 6.0, while the purified fractions TG-BS2 e TG-BS3 showed optimum pH activity at pH 6.5 and also a second peak of activity at pH 10.0
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Estabilização, concentração, purificação e aplicação da transglutaminase microbiana de Streptomyces sp. CBMAI 837
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