Desenvolvimento de um modelo in vitro dos efeitos citotóxicos da ataxina-3 expandida e avaliação de diferentes estratégias terapêuticas para o controle desses efeitos/
Camila Miranda Lopes
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP L881d
[Development of an in vitro model of expanded ataxin-3 cytotoxic effects and evaluation of different therapeutic strategies to control of these effects]
Campinas, SP : [s.n.], 2010.
86 f. : il.
Orientadores: Íscia Lopes-Cendes, Tiago Campos Pereira
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: A ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (DMJ), pertence ao grupo das doenças neurodegenerativas por expansão de poliglutamina e é o tipo de ataxia de herança autossômica dominante mais comum em muitos países. Os efeitos clínicos são variados,...
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Resumo: A ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (DMJ), pertence ao grupo das doenças neurodegenerativas por expansão de poliglutamina e é o tipo de ataxia de herança autossômica dominante mais comum em muitos países. Os efeitos clínicos são variados, incluindo a coordenação motora anormal e morte precoce. O gene MJD1, responsável pela doença, codifica a proteína ataxina-3, uma ubiquitina protease do sistema ubiquitina-proteossomo. Esta proteína quando mutada contém uma expansão consecutiva de 51-86 glutaminas, em contraste com a ataxina-3 normal que apresenta 14-44 glutaminas. Os mecanismos envolvidos na doença estão principalmente relacionados ao mal enovelamento e consequente agregação da proteína mutada, disfunção neuronal e morte celular por apoptose nos neurônios afetados. A investigação de estratégias que interfiram diretamente nos efeitos citotóxicos da doença representa, portanto, um importante enfoque terapêutico. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo in vitro dos efeitos citotóxicos da ataxina-3 mutada a fim de avaliar diferentes estratégias terapêuticas para o controle desses efeitos. O modelo in vitro para a DMJ foi estabelecido com sucesso utilizando a sequência completa do cDNA da ataxina-3 expandida codificando 84 glutaminas. A análise fenotípica das culturas celulares mostrou que nosso modelo apresenta os principais efeitos fenotípicos e citotóxicos da doença, como a formação de agregados protéicos e indução de morte celular. Nós investigamos três estratégias terapêuticas com a finalidade de diminuir a morte celular no modelo in vitro. A primeira, utilizando uma chaperona química (glicerol) teve o intuito de estabilizar a conformação nativa da proteína, auxiliando no enovelamento correto da mesma. Os sais de lítio provavelmente atuam modulando a expressão gênica e poderiam reverter os efeitos citotóxicos causados pela ataxina-3 expandida que levam à disfunção neuronal e à morte celular. A terceira estratégia focou na atenuação da disfunção mitocondrial através de um cofator mitocondrial e antioxidante poderoso, a coenzima Q10. O glicerol, lítio e coenzima Q10 aumentaram a viabilidade das células expressando a ataxina-3 expandida em 16%, 17% e 11%, respectivamente. O aumento de viabilidade resultou da diminuição da população celular em apoptose. Atualmente não existem tratamentos eficazes contra a DMJ, daí a importância de se estudar compostos capazes de reduzirem os efeitos citotóxicos da doença. Esse trabalho estabeleceu um modelo in vitro para a DMJ, bem caracterizado, fácil de ser manipulado no laboratório e de análise fenotípica direta que poderá ser mais explorado futuramente quanto à investigação de novos alvos terapêuticos e à compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patologia da doença. Nossos resultados indicam que o glicerol, o lítio e a coenzima Q10 são bons candidatos para prevenir a morte celular causada pela ataxina-3 expandida e, portanto, estudos adicionais utilizando esses 3 compostos devem ser considerados
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Abstract: Spinocerebellar ataxia-3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD), belongs to a group of neurodegenerative disorders caused by expansion of a polyglutamine stretch, called polyglutamine diseases. MJD is the most frequent inherited autosomal dominant ataxia in many countries....
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Abstract: Spinocerebellar ataxia-3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD), belongs to a group of neurodegenerative disorders caused by expansion of a polyglutamine stretch, called polyglutamine diseases. MJD is the most frequent inherited autosomal dominant ataxia in many countries. Clinical manifestations are varied, including abnormal motor coordination and early death. The protein encoded by MJD1, ataxin-3, is an ubiquitin protease that belongs to the ubiquitin-proteasome system. The responsible for MJD is a trinucleotide repeat expansion (CAG), which leads to an elongated polyglutamine tract in the encoded ataxin-3 protein, varying from 51 to 86 glutamines. On the other hand, normal alleles range between 14 and 44. The mechanisms underlying the disease are mainly related to protein misfolding and aggregation, neuronal dysfunction followed by cell death within the affected neurons. Investigation of strategies that interfere directly with disease cytotoxic effects represents an important therapeutic approach. The objective of this study was to develop an in vitro model that presented the main expanded ataxin-3 cytotoxic effects in order to evaluate different therapeutic strategies to control these effects. The in vitro model for MJD was successfully established using the complete ataxin-3 cDNA coding 84 glutamines. We confirmed that the model presented the main phenotypic and cytotoxic effects of the disease, such as protein aggregates and induction of cell death. We investigated three therapeutic strategies aiming cell death reduction in our in vitro model. The first, using a chemical chaperone (glycerol), was designed to stabilize the native protein and help protein folding. Lithium probably acts by modulating gene expression, and it was used in order to reverse the cytotoxic effects resulted from the disease, such as neuronal dysfunction and cell death. The third strategy focused on attenuation of mitochondrial dysfunction via a mitochondrial cofactor and powerful antioxidant, coenzyme Q10. Glycerol, lithium and coenzyme Q10 increased the viability of cells expressing expanded ataxin-3 in 16%, 17% and 11%, respectively. This augmentation resulted from a decrease in cell population undergoing apoptosis. Currently, there are no effective treatments against MJD, hence the importance of studying compounds capable of reducing disease cytotoxic effects. This work established an in vitro model for MJD, well characterized, and easy to be manipulated and analyzed. This model can be further explored for therapeutic investigations and for better understanding of molecular mechanisms involved in disease pathology. Our results indicate that glycerol, lithium and coenzyme Q10 are good candidates for preventing cell death caused by expanded ataxin-3 and, therefore, further studies with these 3 compounds should be considered
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Lopes-Cendes, Íscia Teresinha, 1964-
Orientador
Pereira, Tiago Campos, 1978-
Coorientador
Castilho, Roger Frigério, 1972-
Avaliador
Paço-Larson, Maria Luisa
Avaliador
Desenvolvimento de um modelo in vitro dos efeitos citotóxicos da ataxina-3 expandida e avaliação de diferentes estratégias terapêuticas para o controle desses efeitos/
Camila Miranda Lopes
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