Resumo: A proteína humana ANKHD1 (Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1) foi inicialmente descrita em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), e sua expressão também é observada em diversas linhagens leucêmicas. ANKHD1 é homóloga a proteína Mask (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain) de Drosophila melanogaster, relacionada com diferenciação, sobrevivência e proliferação de fotorreceptores dos olhos de drosófila. Interações diretas entre ANKHD1 e SHP2, proteína que exerce um papel crítico na hematopoiese, foram descritas nas linhagens mielóide K562, de adenocarcinoma de próstata, LNCaP, e em linhagem de mieloma múltiplo RPM1 8226. Porém pouco se sabe sobre a função de ANKDH1 e seu papel na leucemogênese. O objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento da ANKHD1 em processos biológicos relacionados com a leucemogênese. Para tal utilizamos duas abordagens metodológicas principais: inibição e hiperexpressão de ANKHD1. A inibição de ANKHD1 em linhagem LNCaP foi seguida de rastreamento das demais alterações gênicas associadas através de microarray. O microarray realizado mostrou 706 genes cuja expressão foi aumentada e 159 genes cuja expressão foi diminuída. Os genes foram agrupados em 26 classes funcionais, sendo que diversos genes conhecidos por regularem ciclo celular e apoptose tiveram seu perfil de expressão alterada. Importante ressaltar que a inibição de ANKHD1 resultou em aumento significativo da expressão de um grande número de Histonas, sugerindo seu papel no controle epigenético. Dentre as modulações validadas, algumas foram verificadas também em amostras provenientes de portadores de leucemia. Neste estudo, foi demonstrada a baixa expressão gênica de ANKHD1 em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células de medula óssea normal. Uma vez que esta amostra leucêmica se mostrou como um modelo natural de inibição de ANKHD1, a expressão de outros genes modulados no array foi testada, e o gene BMF, que se mostrou aumentado no array, se mostrou também mais expresso em amostras de leucemias, confirmando a oposição de expressão destes dois genes. Simultaneamente, células de leucemia aguda e mielodisplasia foram submetidas à ação de diversas drogas usadas no tratamento dessas doenças mostrando aumento de expressão de ANKHD1. Estes dados em conjunto com os observados no microarray sugerem a participação da ANKHD1 na via de JAK/STAT1 e vias de controle epigenético. A segunda abordagem utilizada neste trabalho foi a hiperexpressão ANKHD1, isoformas 1 e 2, em linhagens tumorais, seguidas da detecção de expressão protéica de ANKHD1 em cotransfecção com os genes Siva e Vpr. As proteínas Siva e Vpr foram recentemente descritas como capazes de interagir fisicamente com as isoformas 1 e 2 de ANKHD1 respectivamente. Tanto a proteína a Siva quanto a Vpr foram atribuídos papéis de indução de apoptose em linfócitos T. Observou-se que ao cotransfectarmos Siva ou Vpr com ANKHD1 houve diminuição de expressão de ANKHD1 tanto para a isoforma 1 quanto para isoforma 2 (western blotting) e também se observou que a isoforma 1 de ANKHD1 é citoplasmática assim como ocorre com a Mask de drosófila, porém a isoforma 2 se mostrou predominantemente nuclear em microscopia de fluorescência. A análise funcional da hiperexpressão de ANKHD1 seguida de análise por FACS sugere diminuição de apoptose em células leucêmicas. Em conclusão, o presente estudo identificou diversos possíveis participantes da via de sinalização de ANKHD1 por análise microarray, relatou a diminuição da sua expressão em amostras de pacientes portadores de leucemia, bem como o aumento de sua expressão em linhagens leucêmicas sob a ação de diversos tratamentos correntemente utilizados no combate de desordens hematopoiéticas. Descrevemos também o aumento de expressão da expressão do gene BMF nas mesmas amostras em que há diminuição de ANKHD1, corroborando os dados encontrados no microarray da inibição de ANKHD1. Descrevemos também pela primeira vez a localização nuclear da isoforma 2 de ANKHD1, confirmando todas as previsões computacionais de localização de ANKHD1. Os resultados aqui descritos sugerem que ANKHD1 esteja envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 na hematopoiese Ver menos

Abstract: The human protein ANKHD1 (Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1) was initially described in Human prostate adenocarcinoma cells (LNCaP), and can also be expressed in many different leukemic cell lines. ANKHD1 is homologous to the Drosophila melanogaster Mask protein (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), related to differentiation, proliferation and survival in photoreceptors of Drosophila eyes. Direct interactions between ANKHD1 and SHP2, a protein that plays a critical role in hematopoiesis, have been described in the myeloid cell line K562, in prostate adenocarcinome, LNCaP, and in multiple myeloma cell line RPM1 8226. Nevertheless, little is known of the function of ANKDH1 and its role in leukemogenesis. The purpose of this work was to investigate the involvement of ANKHD1 in biological processes related to leukemogenesis. For this purpose, we used two main methodological approaches: ANKHD1 inhibition and overexpression. The inhibition of ANKHD1 in LNCaP cell lines was followed by the tracking through microarray of the remaining associated genetic alterations. Microarray revealed 706 genes with upregulated expression and 159 genes with downregulated expression; the genes were gathered in 26 functional groups and many genes, known for regulating cell cycle and apoptosis, had alterations in their expression profile. Importantly, inhibition of ANKHD1 resulted in significant increase in the expression of a large number of Histones, suggesting its role in epigenetic control. Among the validated modulations, some were also observed in the samples collected from leukemia patients. In this study, the downregulation of ANKHD1 was demonstrated in samples collected from 38 acute leukemia patients when compared to normal bone marrow cells. As this leukemic sample represented a natural model of inhibition of ANKHD1, the expression of other genes processed through array were tested, and the BMF gene, which was upregulated in the array, was also more elevated in leukemia samples. Simultaneously, cells of acute leukemia and myelodysplasia were subjected to the action of various drugs used to treat these diseases showing increased expression of ANKHD1. These data together with those observed in the microarray suggest the participation of ANKHD1 towards JAK/STAT1 and pathways of epigenetic control. The second approach used in this work was the ANKHD1overexpression, isoforms1 and 2, in tumor lines, followed by the detection of protein expression in cotransfection with Siva and Vpr genes. The proteins Siva and Vpr have been recently described as being capable of physical interaction with the isoforms 1 and 2 of ANKHD1, respectively. The role of inducing apoptosis in T lynphocytes was attributed to both Siva and Vpr. By cotrasfecting Siva and Vpr with ANKHD1 a reduction of ANKHD1 expression to isoform 1 as well as to isoform 2 (western blotting) was obtained and isoform 1 of ANKHD1 was observed to be citoplasmatic, such as occurs with drosophila Mask, although isoform 2 happened to be predominantly nuclear in the fluorescence microscope. Functional analysis of overexpression of ANKHD1 followed by FACS analysis suggests reduction of apoptosis in leukemic cells. Finally, this study identified many possible participants in the signaling pathway of ANKHD1 by microarray analysis, and related the reduction of its expression in leukemia patients, as well as the increasing of its expression in leukemic cell lines under the effect of many different treatments currently used against hematopoietic disorders. We also described the increasing of BMF expression in the same samples where we found a reduction of ANKHD1, corroborating all the data we obtained from the ANKHD1 inhibition microarray. In addition, we described, for the first time, the nuclear location of ANKHD1's isoform 2, confirming all the computer-aided predictions regarding the location of ANKHD1. The results herein described suggest that ANKHD1 could be involved with the abnormal phenotype of leukemic cells and these results could guide further studies towards elucidating the specific functions of ANKHD1 in hematopoiesis Ver menos