Orientador: Jose Luiz Pereira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método (modificação do método de Chang e Bergdoll (29)) para a purificação da enterotoxina estafilocócia tipo D (EED); assim como um método de obtenção de antissoro especifico, modificação do método recomendado pelo Food...

Resumo: O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método (modificação do método de Chang e Bergdoll (29)) para a purificação da enterotoxina estafilocócia tipo D (EED); assim como um método de obtenção de antissoro especifico, modificação do método recomendado pelo Food Research Institue (FRI). o método proposto de purificação permitiu uma maior recuperação de toxina em relação ao método de Chang e Bergdoll. O método de imunização de coelhos diminui sensivelmente tanto a quantidade de toxina utilizada como o período de inoculação necessário para atingir o valor pico de anticorpos específicos; em relação ao método do FRI. A enterotoxina foi produzida pela linhagem Staphylococcus aureus 1151m obtido do FRI incubada em frascos de Fernbach de 2,8 litros contendo o meio caldo de triptona 3%, adicionado de extrato de levedura a 1%, sendo o pH final do meio 6,8. o processo de purificação foi monitorado pelo método de eletroforese vertical em gel e pelos métodos sorológicos de precipitação em gel simples (Oudin) e dupla (Ouchterlony modificado - OSP). O método de eletroforese, através do uso de padrões de peso molecular conhecido permitiu constatar em cada etapa de purificação que a proteína purificada era efetivamente a enterotoxina D. Os métodos de precipitação em gel foram utilizados para a quantificação da toxina juntamente com a determinação de proteína pelo método de Lowry. A primeira cromatografia em Amberlite CG-50 teve um rendimento de 72%. A modificação da metodologia foi introduzida na segunda cromatografia onde a CM-Celulose foi substituída por CM-Sepharose CL-6B. Nesta etapa o rendimento foi de 46%. A terceira cromatografia em Sephadex G-75, apresentou um rendimento de 77%. O rendimento final de toxina após o processo completo de purificação foi de 25%. Para a obtenção de antissoro especifico utilizou-se um grupo de 5 coelhos, inoculados em duas etapas com um total de 100µg de toxina durante um período de 35 dias. Pelo método do FRI seria gasta uma quantidade maior que 230µg de toxina, e um período de 3 meses, para se atingir o nível máximo de anticorpos. A toxina foi administrado na coxa posterior por via subcutânea em duas etapas, sendo a primeira com adjuvante completo e a segunda, 21 dias após com adjuvante incompleto de Freund. Os animais foram submetidos à sangria branca por punção cardíaca na segunda semana após a ultima injeção - quando o titulo do soro atingiu valores compreendidos entre 1:16 e 1:32. A atividade imunológica do soro foi monitorada pelo método de 05P que permitiu além da dosagem do anticorpo a determinação da pureza da toxina, evidenciada pelo aparecimento de uma única linha de precipitação em presença do soro polivalente.

Abstract: In this work at was development a new method - modification of the method of Chang and Bergdoll (29) - for de purification of staphylococcal enterotoxin D (SED), and a new method of rabbit's immunization for the preparation of specific SED antisserum. The proposed immunization procedure is...

Abstract: In this work at was development a new method - modification of the method of Chang and Bergdoll (29) - for de purification of staphylococcal enterotoxin D (SED), and a new method of rabbit's immunization for the preparation of specific SED antisserum. The proposed immunization procedure is faster and uses considerably less toxin than the method used by the Food Research Institute (FRIJ. The enterotoxin was produced by Strain Staphylococcus aureus 1151m, from the FRI, incubated in Fernbach flasks of 2,8 liters of capacity, containing tryptone broth 3%, added of yeast extrat to a final concentration of 1%. The medium final pH was adjusted to 6,8. The enteroroxin purification was monitored by vertical gel eletroforesis in the presence of molecular weight standards. This procedure allowed to control each stage of the purification process. On the others side serological method of the precipitation simple (Oudin) and double (modified Ouchterlony - OSP) allowed to determine toxin concentration. The total protein was determined by the Lowry method. The first chromatography through Amberlite CG-50 had a yield of 72%. The modification introduced in this work was at the second chromatography, where CM-Celulose was substituted by CM-Sepharose CL-6B, and the toxin recovery in this step was 46%. The third chromatography through Sephadex G-75 had ayield of 77%. The total yield of SED purification was 25%. To obtain the specific antisserum, a lot of 5 rabbits was inoculated, each animal in two steps, with a total toxin concentration of 100 µg, for a total 35 days period. This procedure has the advantage of using less oxin and less time that the procedure recommended in the literature. The antiserum titers are lower than the titers obtained by the traditional methodology, but high enough to be used as reagents for the sorological quantification of the toxin. The toxin was inoculated in the rabbit tight by the subcutaneous route in two steps, in the first injection 50 µg toxin was inoculated with complete Freund adjuvant, and 21 days later, 50 µg of toxin with incomplete Freund adjuvante. The animals were bleeded to death by cardiac puncture on the second week after the second injection or after the level of antibodies was high enough (above 16) to follow the procedure. The highers titer obtained was 32. The serum titer was determined by the OSP method which allowed al so to determine the toxin purity, this one by the appearance of a single precipitation line - against antisserum produced with crude toxin.