Orientador: Hiroshi Aoyama

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A fosfatase ácida de BPM do rim bovino foi purificada 1.640 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 7%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, tratamento ácido e cromatografia de trocaiônica em SP-Sephadex com eluição por íon-afinidade. Os critérios...

Resumo: A fosfatase ácida de BPM do rim bovino foi purificada 1.640 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 7%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, tratamento ácido e cromatografia de trocaiônica em SP-Sephadex com eluição por íon-afinidade. Os critérios de pureza utilizados foram a A.E., PAGE, SDS-PAGE, filtração em gel (Superdex HR 70) e análise da composição de aminoácidos. A enzima purificada (A.E. de 100 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 13,6 e 17,8 kDa, como determinado através da filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. A composição parcial de aminoácidos (Cys e Trp não foram determinados) foi obtida após a hidrólise ácida da proteína purificada seguida da análise dos resíduos de aminoácidos e evidenciou a existência de, pelo menos, 152 resíduos de aminoácidos. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou uma faixa de pH ótimo de 4,5 a 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 60°C e, nesta temperatura, maior estabilidade no pH 5,5. A atividade da enzima foi relativamente pouco sensível a diversos compostos, reagentes redutores de tióis e íons metálicos, exceto pela inibição por Zn2+ e Cu2+ e pela ativação por guanosina. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki, 0,465 µM), piridoxal-5-fosfato (Ki, 2,18 µM), fosfato inorgânico (Ki, 0,769 mM), pCMB e molibdato de amônio. A energia de ativação para a hidrólise do p-NPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 43,31 kJ.mol-1. A análise da capacidade da enzima catalisar a reação de transfosforilação demonstrou que diversos álcoois atuaram como aceptores de fosfato neste tipo de reação, tendo se destacado o glicerol e o metanol como os melhores aceptores. Dos substratos testados, o p-NPP, ß-Naftil-P, a FMN e a Tyr-P foram os únicos hidrolisados significativamente com KM de 0,14; 0,4; 0,3 e 7,9 mM, respectivamente. A faixa de pH ótimo para a hidrólise da Tyr-P e FMN foi de 5,0 a 5,5

Abstract: A low molecular weight bovine kidney acid phosphatase was purified 1640 fold to homogeneity, with 7% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, acid treatment, and SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution. The following homogeneity criteria...

Abstract: A low molecular weight bovine kidney acid phosphatase was purified 1640 fold to homogeneity, with 7% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, acid treatment, and SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution. The following homogeneity criteria were used: specific activity, PAGE, SDS-PAGE, gel filtration (Superdex HR 70) and amino acid composition. The purified enzyme (specific activity 100 µmol mL-1mg-1) contained a singIe peptide chain and had a reIative moIecuIar mass of 13.6 and 17.8 kDa as determined by gel filtration chromatography and SDS-PAGE, respectively. The partiaI amino acid composition of this enzyme, after acid hydroIysis, showed at least 152 amino acid residues. The amino acid Cys and Trp were not determined. The p-NPP hydrolysis reaction catalyzed by this enzyme had a broad pH optimum of 4.5-5.5 and maximal activity at 60°C. In this temperature the enzyme was more stable at pH 5.5. Reducing thiol compounds, metal ions and other different compounds did not affect significantly the enzyme activity except for the inhibition by Zn2+ and Cu2+ and activation by guanosine. The enzyme was also inhibited by vanadate (Ki, 0.465 µM), pyridoxal-5-phosphate (Ki, 2.18 µM), inorganic phosphate (Ki, .769 mM), pCMB and ammonium molybdate. Both tartrate and fluoride were very weak inhibitors. An activation energy value of 43.31 kJ.mol-1 was determined from Arrhenius plot for the hydrolysis of p-NPP reaction catalyzed by the enzyme. Both glycerol and methanol increased significantly the acid phosphatase activity, acting as good acceptors in the transphosphoryIation reaction also catalyzed by the enzyme. The apparent KM values obtained, at 37°C and pH 5.0, for the best substrates were 0.14 mM, 0.4 mM, 0.3 mM and 7.9 mM for p-NPP, ß-Naphtyl-P, FMN and Tyr-P, respectively. At the same conditions, a pH optimum value of 5.0-5.5, was obtained for the FMN- and Tyr-P-directed acid phosphatase reaction