Orientador : Antonio Celso Novaes de Magalhães

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A utilização de bactérias promotoras do crescimento radicular (PGPR) do gênero Azospirillum, em associação com raízes de trigo, mostrou-se capaz de promover o crescimento da planta, aumentando a produtividade. O modo de ação pelo qual estas bactérias atuam no desenvolvimento radicular ainda...

Resumo: A utilização de bactérias promotoras do crescimento radicular (PGPR) do gênero Azospirillum, em associação com raízes de trigo, mostrou-se capaz de promover o crescimento da planta, aumentando a produtividade. O modo de ação pelo qual estas bactérias atuam no desenvolvimento radicular ainda não está perfeitamente esclarecido. Várias propostas têm sido encaminhadas na tentativa de explicar os fenômenos relacionados à promoção do crescimento por bactérias da rizosfera, dentre as quais a maior eficiência de absorção de nutrientes e de água, a Intensificação da fixação biológica do N2 e os efeitos de substâncias com atividade hormonal, são mais freqüentemente citadas. Isoladamente, nenhuma das opções descritas são suficientes para o esclarecimento dos mecanismos de ação destas bactérias na promoção do crescimento. No presente trabalho foram utilizadas três diferentes estirpes de Azospirillum: JA 03 - Azospirillum lipoferum e JA 04 - Azospirillum brasilense, Isoladas da região tritícola do Rio Grande do Sul; e a 245 - Azospirillum brasilense, utilizada como referência, em função dos seus já conhecidos efeitos. Experimentos iniciais, demonstraram que colônias da estirpe JA 03 apresentaram maior capacidade de multiplicação em temperaturas mais baixas (28 - 30°C), e produziram maior quantidade de ácido indolil-3-acétlco (IAA), tanto na presença quanto na ausência de 100 mg/l de triptofano, do que as estirpes JÁ 04 e 245. Além disso, a estirpe JÁ 03 demonstrou alta capacidade de utilizar nitrato para a respiração, em condições de baixa disponibilidade de oxigênio, acumulando até 800 mg/ml de nitrito no meio, sem afetar o seu crescimento. Esta quantidade de nitrito foi pelo menos 20 vezes superior ao produzido pelas demais estirpes testadas. A inoculação das sementes de trigo com estas estirpes, mostrou que todas induziram aumento no comprimento radicular de plântulas estioladas que variaram de 33,3 até 47,5%, em relação ao controle, e também causaram maior ramificação radicular (4,8 até 18,3%), com destaque para as plântulas inoculadas com a estirpe JA 03. Tendo em vista que estas bactérias colonizam a rizosfera e os espaços Intercelulares das raízes de plântulas Inoculadas, e que seus efeitos sobre o crescimento da raiz pressupõe Intensa atividade, o primeiro encaminhamento experimental foi dirigido ao estudo da ação da Inoculação na extrusão de prótons pelo sistema radicular. Nas situações testadas, a Inoculação com a estirpe JA 03 promoveu maior acidificação do meio de crescimento radicular (100,8%), além de apresentar menor sensibilidade à presença de orto-vanadato, um inibidor da atividade da H+-ATPase da plasmalema, em relação às plântulas não inoculadas. Considerando que um dos pré-requisitos conhecidos para a ocorrência de alongamento celular é a acidificação da parede celular (teoria do crescimento ácido), foi Investigado o fenômeno de extrusão de prótons associado ao efeito do IAA e também do nitrito, uma vez que a estirpe JA 03 apresenta capacidade de produzir ambas as substâncias em meio de cultura. A adição de IAA ou nitrito no meio de crescimento de raízes de plântulas de trigo provocou um aumento significativo da acidificação do ambiente das raízes, sendo que o efeito do IAA foi mais sensível à presença de orto-vanadato do que o do nitrito. Utilizando segmentos de raiz de plântulas de trigo, obtidos da região de alongamento radicular, foi possível demonstrar que a adição de IAA e de nitrito, na concentração de 10-7M, induziu aumento do crescimento do tecido, sendo que o efeito permaneceu até 48h após a incubação. Efeito similar foi demonstrado quando se utilizou o sobrenadante da estirpe JA03 crescida em meio contendo nitrato, que acumulou 363,6 mg/ml de nitrito, numa diluição que correspondeu a 0,8 x 10-7M de nitrito. O sobrenadante do meio de multiplicação desta bactéria, quando crescida em meio contendo amônia, não apresentou nenhum efeito no crescimento. A utilização de Procaína, um anestésico de ação local, adicionada no meio de Incubação dos segmentos de raiz, afetou em menor escala (cerca de 50%) o crescimento mediado por IAA, e quase totalmente o efeito mediado por nitrito. Esta ação, associada ao efeito do orto-vanadato, demonstrou a existência das duas fases de crescimento associadas ao efeito da auxina, e Indicou que o efeito do nitrito está associado à manutenção de um potencial transmembrana. A adição de trifluorperazina (TFP), um antagonista da Ca-calmodulina, Inibiu o crescimento dos segmentos tratados com IAA e nitrito, porém de forma mais pronunciada o efeito devido ao nitrito. Este efeito do TFP, indica, provavelmente, o envolvimento de mensageiros metabólicos específicos, tais como Ca2+ e eventualmente fosfoinositídeos (lP3), nas respostas ao crescimento mediado por IAA e nitrito. Além disso, a utilização de reagentes de grupamentos sulfidrílicos de proteínas com diferentes permeabilidades na membrana, como NEM (Netilmaleimida), diamida, laa (iodoacetamida) e p-HMB (p-hidroximercuribenzoato), sugerem que tanto a resposta devida à IAA como nitrito, estão associadas à proteínas com grupamentos SH essenciais. laa, NEM, diamida e p-HMB Inibiram o crescimento mediado por nitrito e afetaram parcialmente a resposta devida ao IAA. p-HMB anulou completamente o efeito de ambos IAA e nitrito. Nossos resultados sugerem que, aparentemente, os efeitos do IAA e nitrito no crescimento são comandados por diferentes mecanismos; enquanto IAA apresenta uma primeira fase de resposta, de curta duração, relacionada com o relaxamento da parede celular, e a segunda resposta, de longa duração, dependente da Incorporação de material de parede celular, o efeito do nitrito parece estar mais associado à resposta de longa duração, que também provoca relaxamento de parede celular

Abstract: Several experimental evidences have indicated that the association of the soil borne bacteria of the genus Azospirillum with wheat roots can promote plant growth. Inoculation of Azospirillum strains in etiolated wheat seedlings induced significant elongation of the primary root (one...

Abstract: Several experimental evidences have indicated that the association of the soil borne bacteria of the genus Azospirillum with wheat roots can promote plant growth. Inoculation of Azospirillum strains in etiolated wheat seedlings induced significant elongation of the primary root (one strain), in addition to lateral root differentiation (another strain). Our results suggest that the response of bacteria inoculation is probably associated with the capacity of some nitrate-grown bacteria strains to produce appreciable amounts of Indol Acetic Acid (IAA) and nitrite, the later being released into the external medium, particularly under the lower oxygen concentration prevailing In the rhyzosphere. The hormonal-like nitrite effects have been investigated, both In Intact seedlings and root segments. When the diffusate of bacteria medium was added to root segments active elongation occurred, the effect extending up to 24 hours or 48 hours of incubation. Comparable effects were observed as exogenous nitrite was supplied to the root medium, the maximum response measured at 10.7M concentration. Treatment with 10.7M IAA induced essentially the same response. The evaluation of the extent of acidification of the root medium showed that both IAA and nitrite cause proton extrusion, which was inhibited by orto-vanadate solely In the IAA-treated segments. IAA promotion of root elongation was inhibited by Procaine (a membrane depolarizing compound), nitrite-Induced root growth being less affected. The IAA-Induced growth response seems strictly dependent upon active H+ extrusion, whereas nitrite effect might the linked to the existing transmembrane potential. Incubation of the root segments with sulphydryl agents that present differential membrane permeation characteristics, such as lodoacetamlde (lAA), Nethylmaleimide (NEM), Diamide and p-hydroxymercurlobenzoate (p-HMB), suggested that both IAA and nitrite effects might be associated with SH-proteins. Nitrite induced growth was inhibited by lAA, NEM, Diamide and p-HMB, whereas IAA dependent elongation was affected to a lesser extent by the three former compounds; p-HMB completely abolished the growth response of both IAA and nitrite. The promotion of root growth by exogenously supplied IAA and nitrite decreased In segments treated with Trifluoperazine (TFP), a Ca-Calmodulin antagonist, the inhibition being more pronounced In the nitrite treatment. Our data suggest that nitrite an IAA effects are governed by somewhat distinct mechanisms: IAA Is particularly effective on the short-term growth response (181 response) In addition to the long-term growth response (2nd response), leading to wall loosening and matrix Incorporation, respectively. Nitrite affects longer-term events which also result In wall relaxation. The TFP effects probably indicate the requirement of specific metabolic messengers, such as Ca2+ and eventually Phospholnositldes-IP3 (Li+ effect), for hormonal-signaling root growth processes