Orientador: Valdemiro C. Sgarbieri

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola

Resumo: A polifenoloxidase de banana nanica (Musa cavendishii L.) foi extraída da parte central da fruta semi-madura, em solução de tampão fosfato 0,2 M, pH 7,0, contendo II de PVP insolúvel e 0,5a de Triton X-100 por homogeneização em liquidificador na temperatura ambiente. 0 extrato bruto foi...

Resumo: A polifenoloxidase de banana nanica (Musa cavendishii L.) foi extraída da parte central da fruta semi-madura, em solução de tampão fosfato 0,2 M, pH 7,0, contendo II de PVP insolúvel e 0,5a de Triton X-100 por homogeneização em liquidificador na temperatura ambiente. 0 extrato bruto foi precipitado com 2 volumes de acetona previamente resfriada, e a mistura mantida a uma temperatura final de -13°C. O precipitado acetônico foi re-extraído com tampão fosfato pH 7,0, contendo 0,5% de Tri- ton X-100 e estocado a -40°C por 7 dias. O material insolúvel obtido apôs este período, foi eliminado por centrifugação a 12.062 x g por 15 minutos e o extrato, aplicado em coluna de Sephadex G-100 com refrigeração a 5°C. Após eluição da coluna com tampão fosfato 0,01 M, pH 7,0, a fração correspondendo ã maior atividade enzimática (FI:), liofilizada e aplicada em eletroforese de gel de poliacrilamida, deu origem a três bandas ativas, as quais foram cortadas, eluídas em água por 24 horas, dialisadas contra tampão fosfato 0,2 M, pH 7,0 e liofilizadas. A enzima apresentou um grau de purificação da ordern- de 34 vezes. O precipitado acetônico e a fração FE, analisados em gel de poliacrilamida, mostraram o mesmo numero de formas moleculares ativas, que variou de 3 a 5, em presença de diferentes substratos. A polifenoloxidase de banana nanica é uma oxidase específica para o-difenóis, tendo maior especificidade para dopamina, epinefrina e norepinefrina. A enzima no estado purificado, apresentou menor especificidade para substratos na forma D, sendo mais específica para L-dopa (KM = 6,0 x 10-3) do que para D-dopa - (KM = 2,5 x 10-2). Em relação a forma racêmica DL-dcpa, a enzima apresentou especificidade intermediaria (KM = 3,3 x 10-2). O ponto isoelétrico da enzima purificada, determinado por focalização isoelétrica em gel de poliacrilamida, foi de 5,2. Os experimentos por ultracentrifugação era gradiente de sa- carose mostraram um coeficiente de sedimentação de 3,9 ± 0,1 S para polifenoloxidase, correspondente ao peso molecular de - 60.000 ± 2.000. A análise efetuada em gel de poliacrilamida em meio contendo SDS apresentou sub-unidades com peso molecular de 30.000 ± 1.000. Estudos da ação de mercaptoetanol sobre a polifenoloxidase mostraram que a enzima inativada pelo redutor na concentração de 17 mM, tem 30% de sua atividade reativada quando submetida a - diálise. Eletroforese em gel de poliacrilamida apresentou a reativação de duas formas moleculares. Estudos cinéticos, utilizando a enzima no estado semi-purificado (FE) mostraram inibição não competitiva do ácido ascórbico sobre a reação com catecol, nas concentrações de 0,008 mH, 0,04 mM e 0,08 mM. O mesmo tipo de inibição foi observado utilizando metabissulfito de sódio nas concentrações 0,03 mM, 0,06 mM e 0,24 mM. A utilização de cisteína nas concentrações de 0,083 mM e 0,166 mM, apresentou inibição não competitiva com o catecol, passando para cinética do tipo competitivo na concentração de 0,04 mM. A ação inibitória do acido ditió- carbâmico sobre a polifenoloxidase mostrou ser menos efetiva- do que os outros inibidores utilizados. Dentre eles, o ácido-ascórbico mostrou maior inibição sobre a enzima semi-purifiça- da (FE), enquanto que no precipitado acetônico, a cisteína foi forte inibidor com os susbstratos catecol e Dl-dopa. Com exceção do ácido ditiocarbâmico, todos os inibidores apresenta- ram um período de retardamento da reação enzimática. Na reação com DL-dopa como substrato, esse retardamento atingiu tempos superiores a 600 minutos, quando usado 0,4 mM de cisteína na mistura de reação. Os experimentos realizados com o precipitado acetônico e a fração FE, mostraram que a enzima apresenta estabilidade térmica acentuada nas temperaturas de 65 e 75°C, sendo a fração FE aparentemente menos resistente. Estudos preliminares, mostraram evidências de que a enzima encontra-se complexada com compostos fenólicos, principalmente ácido clorogênico. Dentre os vários íons testados como possíveis co-fatores desta. Dentre os vários íons testados como possíveis co-fatores desta reação enzimática, NH4+ e ß-NAD+ agiram como ativadores, sendo que Fe2+, Al3+, Ca2+; Zn2+ e Fe3+, comportaram-se como inibidores. Por outro lado, Cu1+ , Cu2+ , Mg2+ e Mn2+ não interferiram- com a atividade da enzima

Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document.