Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Entre 70 amostras de Escherichia coli verocitoto-xigênicas (VTEC) isoladas de bezerros com diarréia foram selecionadas 4 (55/3, 492, 494/4, 495/2), sorologicamente identificadas como pertencentes ao sorogrupo 0125, que, quando examinadas pela prova de microhemaglutinacão manose-resistente...

Resumo: Entre 70 amostras de Escherichia coli verocitoto-xigênicas (VTEC) isoladas de bezerros com diarréia foram selecionadas 4 (55/3, 492, 494/4, 495/2), sorologicamente identificadas como pertencentes ao sorogrupo 0125, que, quando examinadas pela prova de microhemaglutinacão manose-resistente (MHMR) foram capazes de aglutinar apenas hemácias humanas. Este dado sugeria a possibilidade de que tais amostras fossem produtoras de um antígeno de aderência, por nós designado provisoriamente de EAF44. Suspensões bacterianas destas amostras cultivadas em meio mínimo solido {MMS), incubado a 379C, e/ou o antígeno EAF44 semi-purifiçado obtido a partir destes cultivos, foram estudados através de diferentes procedimentos que incluíram: a) Atividade MHMR comparada com a descrita para outros fatores de colonização tais como: F4,F5,"F41" e "F42"; b) inibição da MHMR, usando-se antissoros homólogos e heterólogos para os antígenos acima mencionados; c) fatores que poderiam influenciar na expressão do antlgeno EAF44 "in vitro", utilizando-se para tal, a prova de MHMR frente a hemácias humanas e/ou microscopia eletrônica. Entre esses fatores selecionamos: temperatura de incubação das culturas, variação de pH do meio de cultura (MMS) e, adição a este de, compostos tais como glicose, acetato de sódio e DL-alanina; d) teste de aderência às células HeLa em presença de D-manose da amostra de VTEC 55/3 cultivada a 379C e a 169C. Inibição desta aderência com antissoro anti-EAF44; e) estudo através da microscopia eletrônica da amostra de VTEC 55/3 produtora de antígeno EAF44, com a finalidade de identificar na mesma a presença de estruturas do tipo fímbria; f) semi-purificação do antígeno EAF44, usando-se técnicas semelhantes âs descritas, com este objetivo, para outros antlgenos de aderência; g) estudos das relações antigênicas entre o antígeno EAF44 e outros fatores de colonização (F4,F5,"F41" e "F42"), descritos em amostras E. coli enterotoxigênicas (ETEC) de origem animal; h) pesquisa, através de teste de alça ligada de coelho, de possíveis alterações histológicas causadas pelas amostras de E. coli 55/3, produtora do antígeno EAF44 e de verocitotoxina (VT). Os principais resultados e conclusões decorrentes destes estudos podem ser assim resumidos: 1) As amostras de VTEC, isoladas de bezerros com diarréia e por nós estudadas, foram capazes de aglutinar, especificamente, na presença de D-manose, apenas hemácias humanas. Resultados semelhantes foram obtidos com o antígeno EAF44 semi-purificado. Este perfil de MHMR mostrou ser totalmente distinto dos descritos para outros fatores de colonização, mas especificamente F4,F5,"F41" e "F42". 2) Os testes de inibição de MHMR mostraram que apenas antissoro anti-EAF44 foi capaz de inibir efetivamente a hemaglutinação das amostras de VTEC (55/3,494/2,494/4, 495/2), sugerindo, portanto, que o antlgeno em questão era antigenicamente diferente dos demais fatores de colonização por nós estudados. 3) Entre os fatores que poderiam influenciar na expressão do antlgeno EAF44 "in vitro" foi verificado que: 3.1. A produção do antlgeno EAF44, quando medida por teste MHMR e verificada através da microscopia eletrônica/ foi inibida quando cultura da amostra VTEC 55/3 era incubada a 169C. Ao contrário, em cultivos incubados a 379C houve produção do antlgeno EAF44. Estes resultados são bastante semelhantes aos observados com outros fatores de colonização, codificados por plasmídios presentes em amostras de ETEC de origem animal. 3.2. A adição de glicose, ao MMS, a semelhança do que ocorre como antlgeno "F42" é necessário para ex pressão deste antlgeno, detectável pela prova de MHMR. 3.3. A adição de DL-alanina ao MMS não interferiu na produção do antlgeno EAF4 4 em culturas da amostra de VTEC 55/3, quando " examinada pela prova de MHMR. Estes resultados são contrários aos observados com os antígenos F5,"F41" e "F42" cuja produção foi inibida por este aminoácido. 3.4. A produção do antígeno EAF44, mediada pela prova de MHMR, foi inibida por acetato de sódio adicionado ao MMS na concentração de lOOmM. Estes resultados foram parcialmente semelhantes aos obtidos, com relação ao antígeno "F42" que, cuja produção, embora inibida por este sal, ocorreu em con contrações menores. 3.5. Culturas da amostra de VTEC 55/3 cultivadas em MMS com pHs que variaram entre 5,4 a 8,2 mostraram, a semelhança do que já foi relatado para os antígenos F5 e "F42", que a produção do antígeno EAF44, também examinada pela prova de MHMR, não ocorreu em pH ácido. Os resultados obtidos nos testes de aderência às células HeLa ,da amostra de E. coli 55/3 cultivada a 379C, mostrou uma aderência do tipo difuso, mesmo na presença de D-manose. 0 teste de inibição de aderência frente a antissoro anti-EAF44 demonstrou que este fenômeno era efetivamente causado pelo antígeno EAF44. Os estudos de microscopia eletrônica, aliados a outros dados referentes a MHMR e aderência ã células HeLa e respectiva inibição destas propriedades por antissoro anti-EAF44, mostraram que este antígeno era constituído por uma estrutura do tipo fímbria, cuja expressão ocorria em cultivos incubados a 379C, sendo porém, inibida
quando a temperatura de inci.bação era 169C. Estes dados são semelhantes aos relatados para outros fatores de co Ionização, presentes em amostras de E. coli do grupo ETEC de origem humana e animal.
6. Os testes de imunodifusão dupla e imunoeletroforese pro varam, que o antígeno EAF44 é antigenicamente diferente dos demais fatores de colonização incluídos na presente pesquisa, ou seja, F4,F5,"F41" e "F42". 7. A inclusão do teste de alça ligada em coelhos, no estudo da amostra de E. coli 55/3 produtora de VT e do antígeno EAF44, partiu do pressuposto de que este antígeno de aderência q na realidade, um provável fator de colonização para os bezerros suceptíveis. Este ensaio te ve, portanto, como objetivo, pelas características do teste, averiguar uma ação direta da VT sobre o epitélio intestinal destes animais. Entre várias alterações observadas foi relevante o achado histológico de uma severa desorganização da estrutura da mucosa do intestino delgado e do intestino grosso, em especial no epitélio do revestimento. Foram observadas ainda alterações na lâmina própria da mucosa, caracterizados por restos nucleares! Estes achados foram semelhantes a outros relatos da literatura sobre experimentos "in vivo" realizados com amostras de VTEC de origem humana e animal. 8. Finalmente, diante de todos os resultados por nós obtidos, podemos afirmar que as amostras de VTEC, isoladas de bezerros com diarréia, pertencentes ao sorogrupo 0125 produzem um antígeno de aderência do tipo fímbria, semelhante em várias propriedades aos antígenos F5,"F41" e "F42", porém, distinto destes, sob o ponto de vista antigênico. Ao que nos consta, é este o primeiro relato na literatura sobre a existência de um antígeno de aderência com estas características em amostras de E. coli do grupo VTEC isoladas de bezerros com diarréia

Abstract: Not informed