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Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A hemocianina do gastropodo terrestre Megalobulimulus ovatus foi purificada e determinou-se a existência de pelo menos dois componentes distintos, a hemocianina (71,5% da hemocianina total) que se dissocia em presença de NaCl 1 M e B hemocianina (28,5% da hemocianina total) que permanece...

Resumo: A hemocianina do gastropodo terrestre Megalobulimulus ovatus foi purificada e determinou-se a existência de pelo menos dois componentes distintos, a hemocianina (71,5% da hemocianina total) que se dissocia em presença de NaCl 1 M e B hemocianina (28,5% da hemocianina total) que permanece associada nessas mesmas condições. O componente ß foi purificado por sedimentação em ultracentrífuga em solução de sacarose 1 M contendo NaCl 1 M e algumas das suas propriedades funcionais e estruturais foram estudadas. Verificou-se que essa hemocianina é uma glicoproteína que possui cerca de 1% em carboidratos, apresenta apenas um grupo sulfidrila por unidade funcional, e este número não se modifica com a remoção de cobre do sítio ativo. A análise por microscopia eletrônica mostrou um padrão semelhante às hemocianinas de outros gastrópodos, apresentando moléculas cilíndricas com 30 nm de diâmetro e 35 nm de altura. Estudou-se a região de estabilidade da molécula associada e a influência de íons Ca2+ e H+ na dissociação da proteína, verificando-se a existência de quatro espécies, uma associada (109 S), uma segunda correspondendo à 1/2 (65,5 S) da espécie anterior, outra sendo 1/10 (22 S) da forma associada e a Última, 1/20 (13 S) da molécula original. Verificou-se que a presença de Ca2+ 20 mM, previne a dissociação alem da espécie 65,5 S em pH até 9,5. Foram preparados antissoros contra as formas associada (109 S) e dissociada (13 S), não tendo sido observada modificações nos grupamentos antigênicos. Já a apo-hemocianina apresenta apenas identidade parcial com a holo-proteína a julgar pelos testes de imuno-difusão em agar, indicando um possível papel estrutural desempenhado pelos átomos de cobre. O efeito da presença do ligante O2, no sitio de ligação em relação à velocidade de remoção dos átomos de cobre por cianeto foi estudado, verificando-se uma proteção contra essa remoção nos primeiros 30 minutos de incubação das formas oxi e desoxihemocianina. Do ponto de vista funcional, a hemolinfa total apresentou P50= 8,2 mm Hg e n50= 2,1 em pH 8,1. As formas associada e dissociada da 8 hemocianina purificada, nesse mesmo pH, apresentaram P50= 7,02 mmHg n50 = 1,7 e P50 = 2,80 mmHg; n50 = 0,9 respectivamente. Em toda a faixa de pH estudada, a forma dissociada apresentou-se não cooperativa (n50 ~ 1) e com afinidade pelo oxigênio sempre maior que a de forma associada, apresentando efeito Bohr reverso muito maior no caso da molécula associada (0,18) que no da dissociada (0,03) na região de pH 7,5 a 8,5.

Abstract: The hemocyanin from Megalobulimulus ovatus, gastropod of terrestrial habitat, was purified. It was shown the presence of at least two components, c* hemocyanin (71.5% of total hemocyanin), which dissociates in 1 M NaC 1 solution and 3 hemocyanin (28.5% of total hemocyanin) which...

Abstract: The hemocyanin from Megalobulimulus ovatus, gastropod of terrestrial habitat, was purified. It was shown the presence of at least two components, c* hemocyanin (71.5% of total hemocyanin), which dissociates in 1 M NaC 1 solution and 3 hemocyanin (28.5% of total hemocyanin) which remains intact in the same conditions. B hemocyanin was isolated by preparative ultra-centrifugation in 1M sucrose solution containing 1 M N a C1 , and some of its functional and structural properties were analysed. This hemocyanin was a glicoprotein containing about 1% in carbohidrates, showed only one sulphydryl group per functional subunit and this number remains after the copper removal. Electron microscopy revealed a pattern quite similar to the hemocyanins from other gastropods, presenting cylindrical molecules with a diameter of 30 nm and 35 nm high. The stability region of the undissociated molecule was determined, and the influence of Ca2+ and H+ ions on the protein dissociation was studied. Four different species were found; 109 S, corresponding to the undissociated molecule; 65.5 S, corresponding to dissociation into halves; 22 S, corresponding to 1/10 molecules, and 13 S, the last degree of dissociation achieved, corresponding to 1/20 of the original molecule. The presence of 20 mfl Ca2+ prevents the dissociation beyond the 65.5 S species up to pH 9.5. Antisera against the whole (109 S) and the dissociated (13 S) species were obtained, double immunodiffusion tests were performed, and no antigenic difference could be observed. The apo-hemocyanin, however, showed only partial identity with the holo-protein, suggesting a possible structural role played by the copper atoms. The presence of oxygen in the binding site showed a protection effect on copper removal by cyanide, at the beggining of the reaction, when comparing oxy and deoxy-hemocyanins. The total hemolymph presented P 5q = 8 .2 mmHg and n^Q= 2.1 at pH 8.1. The undissociated and dissociated purified 6 hemocyanin, at this same pH, presented P50=7,02 mmHg, n50= 1.7 and P5Q- 2.80 mmHg, n5Q = 0.9 respectively. Throughout the studied pH, the dissociated hemocyanin showed to be non cooperative (n^q= T) and its oxygen affinity was always higher than the whole hemocyanin. This showed a reverse Bohr effect of 0.18, six times greater than that found for the dissociated molecule in the pH region 7.5 to 8.5.