Orientador : Benedito de Oliveira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A análise imunoeletroforética do soro imune de Tayassu, utilizando-se como revelador o soro de coelho anti-soro de Tayassu, revelou uma fração protéica de mobilidade eletroforética menos anódina característica de imunoglobulinas do isotipo IgG. Do soro imune deste animal foi purificada, por...

Resumo: A análise imunoeletroforética do soro imune de Tayassu, utilizando-se como revelador o soro de coelho anti-soro de Tayassu, revelou uma fração protéica de mobilidade eletroforética menos anódina característica de imunoglobulinas do isotipo IgG. Do soro imune deste animal foi purificada, por cromatografia de troca iônica em DEAE celulose, uma fração protéica que por análise imunoeletroforética apresentou mobilidade eletroforética lenta em relação ao anodo. Da fração restante, denominada RC, foi purificada a fração protéica, por cromatografia de exclusão molecular, que apresentou volume de eluição típico de imunoglobulinas IgG. A análise imunoeletroforética demonstrou que a
fração obtida por purificação do RC, possui mobilidade eletroforética rápida em relação ao anodo. Por imunodifusão, as frações protéicas denominadas IgG lenta e IgG rápida de Tayassu apresentaram relação de identidade parcial com a IgG monoclonal GOB quando reveladas com o soro especifico anticadeia gama humana, evidenciando que estas proteínas são parte integrante da classe IgG de vertebrados. A digestão pela papaína, da IgG lenta de Tayassu, permitiu a separação desta imunoglobulina nos fragmentos Fab e Fc, por cromatografia de troca iônica em DEAE celulose. Estes resultados indicam que as imunoglobulinas Gde Tayassu devem guardar relação de semelhança estrutural com as demais imunoglobulinas de vertebrados. Por imunodifusão, utilizando-se como revelador o soro de coelho antifragmento Fc de IgG lenta de Tayassu, não foi observada linha de precipitação entre o antisoro e o fragmento Fab de IgG lenta de Tayassu, mas reagiu formando arcos de precipitação com o fragmento Fc purificado e as imunoglobulinas IgG lenta e IgG rápida, onde se nota um "esporão" indicativo de relação e de identidade antigênica parcial entre as proteínas IgG lenta e rápida. A composição global de aminoácidos das imunoglobulinas IgG lenta e IgG rápida de Tayassu apresentou um número de meias cistinas, na forma de ácido cisteico, de 38 resíduos para a IgG lenta e 39 para a IgG rápida, o que sugere um número aproximado de cinco meias cistinas intercadeia pesada (H-H), A IgG rápida apresentou um total de 1314 resíduos e a IgG lenta 1308. O perfil cromatográfico, em Sephadex G100, da separação das cadeias H (pesada) e L (leve) da imunoglobulina IgG lenta de Tayassu é semelhante às descritas na literatura para imunoglobulinas G de outras espécies. A cromatografia de afinidade em Proteína A -Sepharose do soro de Tayassu mostra dois picos correspondentes às frações A e B. A análise imunoeletroforética do material contido na fração B demonstra que a imunoglobulina G de Tayassu ligou-se à proteína A, visto que, esta contém sítios de ligação que mostram uma alta afinidade pela porção Fc da molécula de IgG. Da mesma maneira, a cromatografia de afinidade da fração RC, obtida do soro de Tayassu em DEAE celulose, mostra dois picos correspondentes as frações RCA e RCB. A análise imunoeletroforética do material contido no pico RCB demonstra que a IgG rápida de Tayassu ligou-se à proteína A, como ocorre com IgG de muitas espécies. A análise em gel de poliacrilamida da forma reduzida das imunoglobulinas G lenta e rápida de Tayassu apresentaram pesos moleculares semelhantes ao dos marcadores 19G utilizados. Na forma reduzida as imunoglobulinas G lenta e rápida apresentaram cadeias pesadas (H) com pesos moleculares correspondentes a 50 K (50.000 daltons) e as cadeias leves (L) pesos moleculares correspondentes a 25 K (25.000 daltons), de acordo com os marcadores utilizados: a proteína de Bence Jones, que após redução apresenta-se na forma de monômero, migrando como única banda correspondente àquelas das cadeias leve de imunoglobulinas e proteína monoclonal (GOB) do isotipo IgGl reduzida. As proteínas IgG lenta e rápida de Tayassu, de acordo com as metodologias utilizadas neste trabalho puderam ser qualificadas como imunoglobulinas do isotipo IgG, podendo ser comparadas com classes e subclasses de imunoglobulinas G de vários vertebrados utilizadas para estudos de filogenia molecular do ver modelo IgG

Abstract: Agar immunoelectrophoretic analysis of Tayassu serum developed with rabbit anti-whole Tayassu serum, revealed the presence of a protein fraction with a cathodal electrophoretic migration characteristic of the IgG isotype immunoglobulins. Fractionation in DEAE-cellulose of individual...

Abstract: Agar immunoelectrophoretic analysis of Tayassu serum developed with rabbit anti-whole Tayassu serum, revealed the presence of a protein fraction with a cathodal electrophoretic migration characteristic of the IgG isotype immunoglobulins. Fractionation in DEAE-cellulose of individual Tayassu immune serum gave rise to a protein fraction that was characterized by agar gel immunoelectrophoresis as a single precipitin are present in the region of slow electrophoretic mobility towards the anode. A second fraction obtained from the anion exchange chromatography on DEAE-cellulose called RC when submitted to Sephadex gel filtration gave rise to a protein fraction that had fraction a typical behaviors of 75 IgG immunoglobulins. This fraction purified from RC showed a fast electrophoretic mobility towards the anode when characterized by immunoe1etrocphoresis. In Ouchterlony analysis an antiserum specific to human ? showed a cross-reaction with both slow and fast mobility Tayassu immunoglobulin populations and also with a human monoclonal IgG (IgG GOB). This indicates that both Tayassu protein fractions integrate the IgG class of vertebrate immunoglobulins. Two fragments, Fab an Fc, wen obtained after papain degestron of the Tayassu slow IgG. There findings indicate that the Tayassu G immunoglobulin must follow the structural arrangement characteristic of other vertebrate IgG immunoglobulins. In immunodiffusion analysis a rabbit antiserum to Tayassu slow IgG Fc fragment did not react with Tayassu slow IgG Fab fragment but showed precipiting lines with purified Fc fragment and also with slow and fast IgG immunoglobulins. A spur between these two IgG proteins was also detected and is indicative of partial antigenic identity between them. The global aminoacid composition showed: a) 38 residues of half-cystine (determined as cysteic acid) for the slow
IgG immunoglobulin and 39 residues for the fast IgG immunoglobulin. This suggests an overall number of 5 half-cystine inter heavy chains (H-H) and b) a total of 1308 aminoacid residues for the slow IgG and a total of 1314 aminoacid residues for the fast IgG. The elution profile obtained from gel filtration (Sephadex 6100) indicates that the heavy (H) and length (L) chains of the Tayassu slow IgG immunoglobulin can be separated in a manner similar to that described in the literature for IgG immunoglobulins of other species. Two peaks, A and B, were obtained from Tayassu serum submitted to affinity chromatography on Protein A-Sepharose. Immunoelectrophoretic analysis of peak B shows that the Tayassu G immunoglabulin was bound to protein. A since this protein displays binding sites with high specificity for the Fc portion of the IgG molecule. The fraction RC, obtained from DEAE-cellulose, also showed two peaks corresponding to fractions RCA and RCB. Immunoelectrophoretic analysis of the RCB fraction showed that the Tayassu fast IgG was bound to protein A, as observed for IgG of many species. Polyacrylamide gel electrophoresis of the reduced Tayassu slow and fast immunoglobulins showed that the heavy (H) Tayassu and light (L) chain molecular weights correspond to 50K and 25K, respectively. This is in agreement with the markers used as reference: a human monoclonal IgG protein (GOB) in the reduced form and a human ? Bence Jones protein (JJO) also in the monomeric form after reduction. Based on the immunochemical characterization described both slow and fast Tayassu immunoglobulins can be identified as IgG immunoglobulins. They can be used for further studies conceming the molecular phylogeny of the IgG model