Orientador : Claudio Luiz Messias

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: o objetivo do presente trabalho foi reunir duas linhagens diferentes de Metarhizium anisopliae, e através do ciclo parassexual obter diplóides e segregantes, os quais pudessem ser estudados quanto a produção de destruxlnas, utilizando-se decromatografta de camada delgada (CCD) e gasosa,...

Resumo: o objetivo do presente trabalho foi reunir duas linhagens diferentes de Metarhizium anisopliae, e através do ciclo parassexual obter diplóides e segregantes, os quais pudessem ser estudados quanto a produção de destruxlnas, utilizando-se decromatografta de camada delgada (CCD) e gasosa, sendo esta última acoplada ao espectrômetro de massa (GC-MS). Para isto foram utilizadas duas linhagens: uma de origem norte-americana (F-84) e a outra brasileira (E-9). Estas foram submetidas à ação da luz ultra-vloleta, de maneira a obter-se mutantes morfológicos e auxotróficos. Os mutantes obtidos foram: E-9 am-pir, F-84 vio-tia e F-84 vio-nic, os quais apresentaram-se bastante estáveis com uma frequência de reversão menor que 10-6 conídios. Testes de complementação de pigmentos dos mutantes foram conduzidos e pode-se verificar que os mesmos não produzem a enzima lacase, que tem ação na formação do pigmento selvagem, e assim sendo os diplóides não apresentaram pigmentação verde. Os diplódes foram formados dos cruzamentos de E-9 am-pir x F-84 vio-tia e E-9 ampir x F-84 vto-nic. Ambos apresentaram coloração de um dos parentais (amarelo); estes foram haploidizados com Cloroneb (150µg/ml), surgindo setores amarelos e violetas de formato irregular. Para as destruxinas, foram utilizados os extratos das linhagens selvagens, mutantes, diplóides e segregantes, que foram cromatografados em CCD, apresentando um Rf próximo ao padrão 0,50. Um deles demonstrou Rr abaixo do padrão, (O,44). Na espectrometria de massa, os íons formados determinaram a presença das destruxinas A e B dada pelas frações 576, 7-577,6 e 592,7-593,b respectivamente. Todos os extratos das linhagens analisadas produziram destruxinas, com excecão de dois segregantes S/B-1a e S/B-1b, em cujos extratos não encontradas as duas destruxinas B e A e B. respectivamente

Abstract: In this work the main object was the study of destruxlns production, by diploids and segregants obtained through parasexual cycle in Metarhizium anisopliae. The two parantal strains utilized were E-9 (Brazil) and F-84 (USA), which after induction with UV-radiation produced conidial color...

Abstract: In this work the main object was the study of destruxlns production, by diploids and segregants obtained through parasexual cycle in Metarhizium anisopliae. The two parantal strains utilized were E-9 (Brazil) and F-84 (USA), which after induction with UV-radiation produced conidial color and auxotrophic mutants. The mutants E-9 am-pir, F-84 vio-tia and F-84 vio-nic were utilized because they showed a reversion frequency of auxotrophlc markers lower than 10-6 conidia. The diploids Isolated (E-9 am-pir x F-84 vio-tia and E-9 am-pir x F-84 vio-nic) were all yellow conidiating and showed yellow and violet irregular segregants on Chloroneb (150µg/ml) . As only yellow conidia diploids were isolated it can be suggested that they are not able to produce laccase, which Is the enzyme responsible for wild type (green) pigment formation. Additional tests for laccase production were made with color mutants growing together in a same Petri dish and tt could be deduced that leccase was absent. Destruxtins were analyzed by Thin-layer chromatography (TLC), showing Rf close to the pattern 0,50 and gas chromatography combined with mass spectrography. The mass spectrography showed the presence of destruxins A and B by lons formation in fractions 576,7-577,6 and 592,7-593,6 respectively. One of them showed Rf below to the pattern (0,44). Mass spectrography showed the presence of the destruxin A and B by fractions 576,7-577,& and 592,7-593,6 respectively. AI) the strains analysed produced destruxins, but the sectors S/B-la and S/B-lb, which extracts didn't have destruxlns B and A and B, respectively