Purificação e propriedades de hemaglutininas de uma variedade brasileira de feijão Phaseolus vulgaris, L.
Roberto Gonçalves Junqueira
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP J968p
[Purification and properties of hemagglutinin from a variety of Brazilian bean Phaseolus vulgaris, L]
Campinas, SP : [s.n.], 1979.
83 f. : il.
Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola
Resumo: Foi realizado um estudo inicial de extração, fracionamento e recuperação das proteínas e da atividade hemaglutinante de sementes de feijão Rosinha G2 (Phaseolus vulgaris). O extrato bruto foi obtido em NaCl O,5M, e as proteínas foram fracionadas por diferença de solubilidade em meios de...
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Resumo: Foi realizado um estudo inicial de extração, fracionamento e recuperação das proteínas e da atividade hemaglutinante de sementes de feijão Rosinha G2 (Phaseolus vulgaris). O extrato bruto foi obtido em NaCl O,5M, e as proteínas foram fracionadas por diferença de solubilidade em meios de baixa força iônica, após diálise por 36 horas contra água destilada. A atividade mostrou maior tendência em concentrar-se na fração solúvel (ALB), contudo, uma atividade específica hemaglutinante quatro vezes menor foi detectada na fração insolúvel (GLB). Eletroforeticamente, estas frações não se mostraram completamente distintas e quando foram fracionadas pelo tamanho molecular de seus constituintes, por cromatografia em SephadexG-200, a atividade hemaglutinante apresentou-se, aproximadamente, em uma mesma faixa de peso molecular.A hemaglutinina do feijão Rosinha G2 foi purificada por uma sequência de etapas envolvendo cromatografia de afinidade em ConA-Sepharose e cromatografia em gel de Sephadex G-200. A análise eletroforética, em géis de poliacrilamida, a pH 8,4, da preparação obtida na primeira etapa da purificação, componente CII-Af, indicou que a atividade hemaglutinante é devida à presença de, pelo menos três grupos de glicoproteínas. A preparação obtida na última etapa de purificação, componente CII-S, apresentou-se corno urna banda larga e densa, sendo o perfil interpretado corno um fenômeno de agregação entre os constituintes da preparação hemaglutinante final. Quando este material foi analisado por eletrofocalização em gel de polia crilamida revelou que a atividade hemaglutinante é devida ao componente de ponto isoelétrico na faixa de pH de 5,5 - 5,7, sendo contaminado, principalmente, por um componente de ponto isoelétrico em pH = 4,7, que não apresentou atividade hemaglutinante. Foi observado que os eritr5citos bovinos, tripsinizados, quando tratados com soluções de hemaglutinina, mostravam afinidade por superfícies de acetato de celulose. Esta afinidade foi interpretada como interações inespecíficas, devidas a forças de natureza polar, que foram também responsabilizadas pela agregação observada no componente CII-S. A hemaglutinina purificada, CII-S, teve sua composição de aminoácidos determinada, revelando-se deficiente em aminoácidos sulfurados (traços) mas rica em ácido aspártico (11,64%) e serina (7,66%). Revelou-se uma glicoproteína, contendo 8,30% de açúcares neutros e 2,21% de glicosamina. Por cromatografia em gel, a hemaglutinina apresentou um raio molecular de Stokes de 43 A e um peso molecular de 136.000, O raio molecular foi utilizado para o cálculo de sua constante de difusão, 5,0 cm2.s-1. Por ultracentrifugação em gradiente de densidade, foi determinado seu coeficiente de sedimentação, 6,9S e calculou-se seu volume específico parcial, 0,75 ml.g-l, pela equação de Svedberg, para uma diluição infinita. Estes dados foram utilizados para estimar-se o comportamento hidrodinâmico da hemaglutinina, pela determinação de seu quociente friccional, f/f= 1,3. Este valor indica que a proteína pode assumir combinações de hidratação e as simetria dentro dos seguintes limites: 0,9g de água por grama de proteína e a/b = 6, se o modelo de um elips5ide prolato for escolhido. As propriedades químicas e físico-químicas, determinadas para a hemaglutinina do feijão Rosinha G2, mostraram que é semelhante em muitos aspectos fundamentais a outras hemaglutininas purificadas, de diferentes variedades de Phaseolus vulgaris
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Abstract: The present is a preliminary study on some physicochemical properties of the bean (Phaseolus vulgaris, variety "Rosinha G2")proteins such as solubility, electrophoretic mobility,molecular weight distributions and hemagglutinating activity. The crude extract was prepared by extracting the...
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Abstract: The present is a preliminary study on some physicochemical properties of the bean (Phaseolus vulgaris, variety "Rosinha G2")proteins such as solubility, electrophoretic mobility,molecular weight distributions and hemagglutinating activity. The crude extract was prepared by extracting the flour with a O.5M NaCl solution. The proteins were fractionated using their differences in solubility as the ionic strength was lowered by means of dialysis against distilled water for 36 hours. Most of the hemagglutinating activity was found in the soluble fraction (albumins). Some activity was detected in the insoluble fraction (globulins), which was four times lower than that found in the albumins. However, it was shown electrophoretically that the hemagglutinating components were similar in both fractions. When the protein constituents were separated on the bases of their molecular size, the hemagglutinating activity was found approximately on the same range of molecular weights. The hemagglutinin prepared from this bean was obtained by a sequence of steps involving affinity chromatography on ConA-Sepharose and gel chromatography on Sephadex G-200. The agglutinating preparation obtained by affinity chromatography, component CII-Af, was shown by polyacrylamied-gel electrophoresis to be composed of, at least, three groups of active glycoproteins. Under the same conditions, the preparation obtained at the last step of purification, component CII-B, gave a broad band, which was interpreted to be the result of aggregation. The gel-electrofocusing pattern of this material showed that the hemagglutinating activity was associated with the component separated in the pH range of 5.5-5.7. Other in active components were also present, particularly at pH4.7. It was noted during the hemagglutinating activity tests that the erythrocytes after treatment with hemagglutinin solutions adhered to the cellulose acetate surfaces. This affinity was probably due to nonspecific interactions occuring between groups of polar nature, which could be responsible for the aggregation of the constituents of CII-S.The purified hemagglutinin was characterized as a glycoprotein, containing 8.30% of neutral sugars (as mannose) and 2.12% of hexosamine (asglucosamine). It was shown to be deficient in sulfur ¿ containing amino acids (traces) but rich in aspartic acid(11.64%) and serine (7.66%). The hemagglutinin revealed a Stokes radius of 43R and a molecular weight of 136,000, as obtained by gel chromatography. The molecular radius was used to calculate the approximate value of the diffusion constant, D20,w = 5.0 x 10-7cm2.s-1. The sedimentation coefficient which was determined in a linear sucrose density was 6.9S. These parameters were substituted in the Svedberg equation to determine its partial specific volume, v = 0.75 ml.g-l. The hydrodynamic behavior of the hemagglutinin was estimated by the calculation of its frictional ratio, f/fo = 1.3. This value indicated that the protein had a maximum hydration of 0.9 g of water per gram of protein and a maximum axial ratio, a/b = 6 if a prolate ellipsoid of revolution was chosen as the model. The chemical and physicochemical properties of the hemagglutinin' prepared from the bean "Rosinha G2" were similar in many fundamental aspects to other hemagglutinins obtained from the seeds of different varieties of PhaseoZus vuZgaris
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