Orientador : Renato Bonatelli Junior

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia

Resumo: O presente trabalho teve como objetivos principais, verificar a ocorrência do ciclo parassexual em Aspergillus awamori, testar a produção de amiloglicosidase dos derivativos, mutantes e diplóides obtidos e realizar o cruzamento interespecífico com A. niger. Além desses, estudos foram...

Resumo: O presente trabalho teve como objetivos principais, verificar a ocorrência do ciclo parassexual em Aspergillus awamori, testar a produção de amiloglicosidase dos derivativos, mutantes e diplóides obtidos e realizar o cruzamento interespecífico com A. niger. Além desses, estudos foram desenvolvidos com a instabilidade apresentada por A. awamori.. A linhagem NRRL 3112 segrega conídios pro e forma setores espontaneamente. Este comportamento não seria o esperado para um clone e sugere a existência de heterozigose para as características estudadas, a qual poderia estar contida numa duplicação parcial ou total de genoma. Mutantes auxotróficos e morfológicos de Á. awamori foram conseguidos utilizando-se os métodos de isolamento total e de enriquecimento por filtração. Este último mostrou freqüências de isolamento 12 vezes maiores. Mutantes resistentes ao Brometo de Etídio também foram isolados, mas somente após indução com luz ultravioleta. Os mutantes foram utilizados em cruzamentos que permitiram verificar a ocorrência do ciclo parassexual. Através da análise dos segregantes, pode ser evidenciada ligação entre os genes etbl, grel bwnl; morl, arg2 e leul, mor2. O gene pabl segregou independentemente e, assim, foi possível sugerir 4 como o numero mínimo de grupos de ligação nessa espécie. Entre os critérios não geneticos utilizados na caracterização, o diâmetro de conídios e o tratamento com Benlate mostraram-se eficientes para separar haplóides de diplóides. O método de extração e quantificação de DNA por núcleo também foi adequado para esse fim. Com relação ã enzima, o primeiro passo foi averiguar se o método empregado estava medindo a atividade da amiloglicosidase, fato que foi confirmado fazendo o teste com o inibidor e a dextrina limite. Foi constatada uma relação inversamente proporcional entre a porcentagem de segregação de conídios pro e a produção de amiloglicosidase. Só foi possível obter o cruzamento entre A. awamori e Á. niger através de fu são de protoplastos. A freqüência de formação de colônias prototróficas foi relativamente baixa, situando-se na faixa de 0,6%, possivelmente devido ao pequeno número de protoplastos utilizados para a fusão e a um provável efeito tóxico diferencial do agente fusogênico utilizado. As colônias prototróficas isoladas inicialmente puderam ser classificadas como heterocarióticas. A partir destas, o produto de fusão híbrido foi obtido na forma de setores que exibiam complementação entre as marcas genéticas das parentais. Através da análise do híbrido, pode ser evidenciada ligação entre os genes nicl, 0lv2, bwnl, amy, pro. Houve distribuição ao acaso dos grupos de ligação, semelhante ao esperado para um diplóide intra - específico sugerindo alto grau de homologia cromossômica entre as duas espécies. Os mesmos critérios de caracterização utilizados com sucesso para separar linhagens haplóides de diplóides. nos cruzamentos intra-específicos foram adotados e também nesse caso mostraram resultados satisfatórios

Abstract: The present work with Aspergillus was done aiming to study the following: 1- Occurrence of the parasexual cycle;2- Occurrence of interspecific hybridization with A. niger.3- Amyloglucosidase production of the parental and derived strains, including auxotrophic mutants, diploids and the...

Abstract: The present work with Aspergillus was done aiming to study the following: 1- Occurrence of the parasexual cycle;2- Occurrence of interspecific hybridization with A. niger.3- Amyloglucosidase production of the parental and derived strains, including auxotrophic mutants, diploids and the interspecific hybrid. During the first stage of the work, it was observed that the NRRL 3112 strain of A. awamori is unstable because it spontaneously segregates pro conidia (deficient for proline synthesis) and produces sectors. The last characteristic is also observed in pro derivatives and it was supposed that it is independent from pro conidia segregation. These characteristics are not expected from a clone and together with other evidences (Benlate segregation, differential susceptibility to acetone, variation in number of nuclei per conidia and conidial diameter), it was suggested that there is a partial or total duplication of the genome. Auxotrophic and morphological mutants of A. awamori were induced by ultraviolet light and selected by using total isolation and filtration enrichment methods. An increase of 12 times in the mutant frequency was observed when the last method was employed. Ethidium bromide resistant mutants were also isolated only after ultraviolet induction. Diploid strains were readily obtained and could easily be' separated from haploid strains by conidia diameter, Benlate segregation and nuclear DNA content. Segregation analysis indicated linkage between etb1 gre1 bwn1, mor1, arg1 and leu1, mor2. Because pab1 marker segregated independently from all others it was suggested at least 4 linkage groups for A. awamori. Only heterokaryotic colonies were detected when A. awamori and A. niger protoplasts were fused and plated in selective medium. The low frequency (0,6%) and the heterokaryotic nature of the colonies could probably be attributed to: 1) low protoplasts number and 2) toxic effect to the fusogenic agent to A. niger protoplasts. Hybrid colonies were isolated after several transfers in selective medium. The hybrid nature of these colonies was established by the same criteria used in the intraspecies crossing. Segregation analysis indicated a high level of chromosomal homology between the 2 species and it was possible to suggest linkage between nic1 olv2 genes of niger and bwn, amy, pro of awamori. As it was evident from the use of limit dextrin and a specific inhibitor. glucoamylase is the main enzyme activity detected by the usual assay procedure. It has also been detected that high. frequency of pro conidia in A. awamori is correlated with the low level of enzyme production