Orientador: Yong Kun Park

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola

Resumo: De duzentos e quarenta e nove linhagens de microrganismos isolados do solo foi encontrado quatro linhagens produtoras de tirosinase, das quais escolheu-se a linhagem que produziu maior atividade de tirosinase. Esta, foi classificada como Bacillus subtilis e verificada que produz a enzima...

Resumo: De duzentos e quarenta e nove linhagens de microrganismos isolados do solo foi encontrado quatro linhagens produtoras de tirosinase, das quais escolheu-se a linhagem que produziu maior atividade de tirosinase. Esta, foi classificada como Bacillus subtilis e verificada que produz a enzima intracelularmente. Dentre vários meios de cultura testados, o microrganismo crescido no meio constituído de 1% de peptona, 1% de levedura e 2% de glicose, a pH 7,0 , apresentou melhor rendimento na produção de tirosinase. O estudo da produção de tirosinase por B.subtilis foi realizado no minifermentador da New Brunswick modelo M-1000, à 30°C e 1 vvm de aeração, com o meio de cultura acima descrito. No decurso da fermentação foi verificado que o valor de pH do meio de cultura cai durante a fase exponencial de crescimento, retornando ao nível ligeiramente acima do inicial no fim dessa fase. A produção da enzima foi verificada no fim da fase exponencial de crescimento, atingindo o máximo de produção ã 48 horas de incubação, com uma atividade 5,7 x 102 unidades de tirosinase por mililitro de suspensão celular. Algumas características enzimáticas da tirosinase intracelular e B.subtilis foram estudadas na forma semipurificada e na forma de enzima imobilizada natural (cell-bound enzyme).A enzima emipuríficada pelo fracionamento com sulfato de amônio apresentou pH ótimo 7,0 , temperatura ótima de 25°C e estabilidade em pH na faixa de 6,0 a 7,5. A sua atividade não foi alterada na presença de ions metálicos como Al2(SO4)3, MgSO4, MnSO4, CuSO4, BaSO4, CaCl4, CoCl2 e KCl, porém foi inibida na presença dos agentes quelantes KCN, tiouréia, dietilditiocarbamato de sódio e cisteina. A eletroforese da tirosinase semipurifiçada mostrou que a enzima move em direção ao cátodo à pH 4,0. O estudo cine tico da enzima apresentou respectivamente para os valores de Km e Vmax 7,5 x 10-4M de L-tirosina e 13,5 x 10-3 umoles de L-DOPA/min/mg de proteína. A tirosinase na forma de enzima imobilizada natural apresentou características semelhantes à tirosinase na forma semipurificada, exceto na cinética de enzima , sendo obtido os valores de 9,0 x 10-4 M de L-tirosina e 7,1 x 10-4 ?moles de L-DOPA/min/mg de massa celular, respectivamente para Km e Vmax. A conversão de L-tirosina ã L-DOPA pela tirosinase de B.subtilis foi realizada com suspensão de células intactas contendo 11 x 10-4 unidades de tirosinase por mililitro e substrato L-tirosina em três diferentes concentrações. Estes foram incubados ã 30 C, pH 7,0, por 40 horas, adicionando-se periodicamente ácido ascórbico para prevenir a oxidação do produto formado. O máximo de conversão de L-tirosina para L-DOPA foi obtido quando a concentração do substrato foi de 12mM

Abstract: Two hundred forty nine strains of microorganisms were isolated from soil, and four strains were to be producers of tyrosine. One o£ strains, wich is classified as Bacillus subtilis , was best producer of tyrosinase, and the enzyme was produced intracellulary. The best culture medium for...

Abstract: Two hundred forty nine strains of microorganisms were isolated from soil, and four strains were to be producers of tyrosine. One o£ strains, wich is classified as Bacillus subtilis , was best producer of tyrosinase, and the enzyme was produced intracellulary. The best culture medium for the production of tyrosine by B. subtilis was found to be: 1% peptone, 1% yeast and 2% glucose, at pH 7,0. The study on the enzyme production by the strain was done with the culture medium, described above in a minifermentor (New Brunswick model M-1000) at 30°C with aeration (one volume / volume/minute). Time course of fermentation by B.subtilis demonstrated that the pH has fallen during exponential cell growth and elevated at the end of the phase.Enzyme production has begun at end of the exponential cell growth and achieved maximum enzyme production at 48 hours of incubation with an activity of 5,7 x 10 units of tyrosinase per milliliter of cell suspension. Characterization for both, cell bound and semipurified tyrosinase from B.subtilis were studied. The semipurified enzyme with ammonium sulfate fractionation showed as following. Optimum pH and temperature were around 7,0 and 25°C. The enzyme was stable at pH between 6,0 and 7,5. Metal ions such as Al2(SO4)3, MgSO4, MnSO4, CuSO4, BaSO4, CaCl4, CoCl2 and KCl not influenced on tyrosinase activity. KCN, thiourea, sodium diethildithiocarbamate and cysteine have inhibited the enzyme activity. Eletrophoretic behavior of tyrosinase showed that the enzyme moved forward cathod at pH 4,0. Kinetic study of the enzyme showed that values of both Km and Vmax were 7.5 x 10-4 M of L-tyrosine and 13.5 x 10-3 ?moles of L-DGPA/min/mg of protein, respectively Cell bound tyrosinase exhibited similar characteristics except enzyme kinetics and values for both Km and Vmax were 9.0 x 10-4 M of L-tyrosine and 7.1 x 10~4 ?moles of L-DOPA/min/mg of cell suspension. Conversion of L-tyrosine to L-DOPA by B.subtilis tyrosinase was performed by cell bound tyrosinase containing 11 x 10 * units of enzyme activity per ml and substrate (L-tyrosine) of three différents concentrations, at 30°C, pH 7,0 for 40 hours, and
periodicaly ,ascorbic acid was added to reaction mixture to prevent further oxidation of the product.The maximum conversion of L-tyrosine to L-DOPA was obtained when the substrate concentration was 12 mM