Orientador : Yong Kun Park

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: De 695 microrganismos isolados do solo e de material clínico, foram encontrados quatro produtores da enzima penicilina amidase , sendo o maior produtor destenzima, uma linhagem de E.coli FEA 30. Verificou-se que esta enzima intracelular, e que o ácido fenil acético induz sua produção....

Resumo: De 695 microrganismos isolados do solo e de material clínico, foram encontrados quatro produtores da enzima penicilina amidase , sendo o maior produtor destenzima, uma linhagem de E.coli FEA 30. Verificou-se que esta enzima intracelular, e que o ácido fenil acético induz sua produção. Encontrou-se que o melhor meio de cultura, na produção da enzima penicilina amidase, por E.colí FEA 30 foi: l% de peptona, 0,5 % de extrato de levedura e 0,15% de áicido fenil acético, com pH de 7,0 antes de autoclavagem. A melhor temperatura de incubação, na produção da enzima foi de 23ºC. Um meio de cultura na produção da enzima penicilina amidase com possibilidades de ser usado, a nível industrial foi: 2% de farelo de soja desengordurado, 1% de extrato preparado pela autólise de Saccharomyces cerevisiae, da Fleischmanne, 0,15% de ácido fenil acético, com pH de 7,.0 antes da autoclavagem. Depois de colocar uma suspensão de E.coli FEA por 50 minutos em uma solução de N-metil-N¿-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), foram isoladas 800 linhagens, das quais foi obtida uma mutante denotada como E.coli FEA 30 MQI. Esta mutante produz duas vezes mais penicilina amidase do que a linhagem selvagem, à temperatura de incubação de 25°C. Com esta linhagem mutante E.coli FEA 30 MQl, foi feita novamente indução de mutação e dentre 1.000 linhagens isoladas após a exposição de 50 minutos em MNNG, foi encontrada uma linhagem E.coli FEA 30 MQ2, que produz 120% a mais enzima que a selvagem. Tanto E.coli FEA 30 MQl como E.coli 30 de MQ2. quando inoculadas tem meio infimo de: 15g de KH2PO4' 10 g de glicose, Z g de sulfato de amonia, 0,2 g de sulfato de magnisio, com pH ajustado a 7 com hidróxido de sódio, não apresentaram divisão celular, cresccendo em forma filamentosa às temperaturas de incubaçio de 25°C a 37ºC. Com a indução de mutação com raios ultravioletas, não foi possível. encontrar mutante hiperprodutiva, ainda que nestas condições foram conseguidas mutantes auxotrofos e outras a ß galactosidase-negativas. A enzima penicilina amidase de E. coli apresentou atividade máxima a temperatura de 40ºC, sendo pH ótimo entre 8,0 e 8,5, seu valor da constante de Michaelis Km foi 37 mM e Vm foi l µmol/min/ml. Na produção de 6APA, por penicilina amidase e penicilina G, à temperatura de incubação de 40°C, usando-se uma concentração de 7% de penicilina G, contendo 0,83 unidades de enzima por mililitro, conseguiu-se uma conversão de 90% em 20 horas de incubação, obtendo-se posteriormente uma recuperação de 70% do 6APA produzido.

Abstract: Of 695 microorganisms isolated from soil and clinical material, four were proved to be producers of penicillin amidase, the principal producer of the above enzyme being a lineage of E.coli FEA 30. It was verified that the enzyme was intracellular and that its production is induced by...

Abstract: Of 695 microorganisms isolated from soil and clinical material, four were proved to be producers of penicillin amidase, the principal producer of the above enzyme being a lineage of E.coli FEA 30. It was verified that the enzyme was intracellular and that its production is induced by phenylacetic acid. The best culture medium for the production of penicillin amidase by E.coli FEA 30 was found to be: 1% of peptone, 0,5% of yeast extract and 0,15% of phenylacetic acid, with pH 7,0 before autoclaving. The optimal temperature of incubation for the production of the enzyme was 23°C. For industrial purposes an appropiate culture medium would be: 2\ of defatted soybean meal, 1% of an extract prepared by autolysis of Saccharomyces cerevisae of Fleischmann and 0,15% of phenylacetic acid with pH 7,0 before autoclaving. After placing a suspension of E.coli FEA 30 for 50 minutes in a solution of N-methyl-N'-nitro-N-nitroguanidine (MNNG), there were isolated about 800 lineages from which there was obtained a mutant denoted as E.coli FEA 30 MQ1. This mutant produces twice as much penicillin amidase than does the wild lineage at an incubation temperature of 25°C. The mutant E.colí FEA 30 MQl, was subjected again to a mutation process and of the 1.000 lineages isolated after 50 minutes immersion in MNNG solution there was encountered amutant lineage denoted as E.coli FEA 30 MQ2 which produces 120% more of the enzyme than the wild one. Both E.coli FEA MQl and E.coli FEA MQ2 when inoculated in minimal medium of: l5g of KH2PO4, 10 g of glucose, 2 g of (NH4)2SO4 and 0,2 g af MgSO4, with pH adjusted to 7,0 with sodium hydroxide, did not show cellular division, but grew of in a filament form at an incubation temperature 25°C to 37°C. When inducing the mutation with ultraviolet rays it was not possible to obtain a penicillin amidase hyperproductive mutants even if under these conditions mutants such as auxotrophic and others with negative ß-galactosidase were encountered. The penicillin amidase of E.colí showed maxirnum activity 40°C, the optimal pH being between 8,0 and 8,5. The value at of its Michaelis constant Km was 37 mM and its Vm was l µmol/min/ml. When employing an incubation temperature of 40°C and a penicillin G concentration of 7% with 0.83 enzymes units per ml, a conversion of 90% of the penicil1in into 6APA in 20 hours of incubatian was achieved. Seventy % of the above yield was recuperated.