Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: O presente trabalho teve como principais objetivos o isolamento, o estudo da composição e do valor nutricional das principais frações protéicas do feijão (Phaseolus vulgaris, L) var. Rosinha G2, além da purificação e do estudo das propriedades dos inibidores da tripsina e da quimotripsina,...

Resumo: O presente trabalho teve como principais objetivos o isolamento, o estudo da composição e do valor nutricional das principais frações protéicas do feijão (Phaseolus vulgaris, L) var. Rosinha G2, além da purificação e do estudo das propriedades dos inibidores da tripsina e da quimotripsina, presentes na fração albumina (F1). A extratibilidade das proteínas foi estudada em função do pH e da concentração salina ou força iônica do meio solvente. Em soluções ácidas (pH < 3) ou alcalinas (pH > 8) conseguiu-se extrair entre 85 e 9S% do nitrogênio total da farinha integral. A faixa de pH de menor extratibilidade foi entre 3,5 e 5,0. Duas extrações sucessivas da mesma amostra, a primeira com água destilada e a segunda com solução 0,5M de NaCl, extraia pelo menos 80% do nitrogênio da farinha integral. Extração fracionada da mesma farinha com vários solventes revelou que 481% do nitrogênio total era extraído com água destilada, 25,6% com solução 0,5M de NaCl, 19,3% com tampão borato de sódio pH 10,0, côn tendo 0,5% de mercaptoetanol e 0,5% de lauril sulfato de sódio, perfazendo a extração de 92,8% do nitrogênio total. Tratamento dos grãos a 97°C por vários intervalos de tempo mostrou que a solubilidade das proteínas em água diminuía de, praticamente 50%, após 5 min de aquecimento, tornando-se essencialmente insolúvel depois de 60 min de aquecimento. O aquecimento dos grãos por 4 min a 97 ºC inativou, completamente, os inibidores de tripsina e de quimotripsina. A diálise de um extrato salino permitiu a separação das proteínas em duas frações: solúveis em água (301) e insolúveis (701). Cerca de 70 - 75% do nitrogênio do extrato bruto era recuperado após 72h de diálise. A maior atividade inibidora de tripsina e de quimotrisina era encontrada nas proteínas solúveis em água (albuminas). Aquecimento das albuminas (IS min, 9 7 ºC) coagulava 65 - 70% das proteínas. Os inibidores de tripsina e de quimotripsina permaneciam em solução na fração não coagulável, sem sofrer nenhuma inativação. 0 isolamento e a purificação desses inibidores foram conseguidos, a partir da fração albumina não coagulável, pela precipitação com sulfato de amónio 0,65 de saturação, ultrafiltração em gel de Sephadex G-50, cromatografia em colunas de DEAE-celulose e eletroforese em gel de poliacrilamida. O grau de purificação alcançado foi de 31 vezes em relação ao extrato bruto, Todas as frações proteicas isoladas continham carboidrato em várias proporções. Os monossacarídeos identificados no hidrolisado ácido da fração albumina foram glicose, manose, ara binose, galactose e xilose. A preparação purificada (IG-50) côn tinha 3,751 de carboidrato total, que no hidrolisado aparecia
como manose e xilose, além da glicosamina que ficava retida na coluna de troca catiônica. Quanto aos aminoácidos, a característica comum a todas as proteínas dessa variedade de feijão foi o teor bastante baixo de metionina, sendo que a fração albumina apresentou um teor mais elevado que as proteínas insolúveis em água. Os inibidores isolados da fração albumina apresentaram concentrações elevadas dos aminoácidos cistina, serina, treonina e prolina, além dos aminoácidos aspartico e glutimico. Apresentaram, porém, concentrações muito baixas de metionina, valina, leucina, tirosina e fenilalanina. O triptofãnio e a cisteína estavam totalmente ausentes das moléculas dos inibidores. Foram determinados para os inibidores isolados em colu na de Sephadex G-50 os seguintes parâmetros moleculares: pesomolecular 20.000, volume específico parcial 0,69, raio molecular 20A, coeficiente de difusão 10,7 x 10-7 e um quociente friccional de 1,14. A isoeletrofocalizaçao indicou a presença de dois componentes proteicos ativos na preparação obtida em colunas de Sephadex ou de DEAE-celulose, um a pH 5,1 e outro a pH 6,0, indicando que essa preparação não era totalmente homogenea, o que foi também verificado na eletroforese em gel de póliacrilamida. Testes de incubação, primeiro com tripsina e depois com quimotripsina, ou vice-versa, sugeriram que os inibidores possuem em suas moléculas centros de ligação separados e inde pendentes para inibição da tripsina e da quimotripsina. A inibição em presença da caseína como substrato foi do tipo não competitivo para as duas enzimas. A inibição da trípsina em presença de benzoil-DL-arginina p-nitroanilida (BAPNA) foi do tipo misto.
A preparação (16-50) foi 3,6 vezes mais ativa sobre tripsina humana que sobre a tripsina bovina. Quando em solução aquosa, os inibidores exibiam uma resistência térmica muito grande, sendo porem, inativados pelo aquecimento em pH alcalino ou em presença de agentes redutores das ligações dissulfídicas. A oxidação com ácido performico produziu, também, a completa destruição do poder inibidor. O valor nutricional de todas as frações protéicas isso ladas dessa variedade de feijão foi bastante baixo, verificando- se uma melhoria surpreendente dos índices nutricionais, com a adição às dietas, dos aminoácidos sulfurados metionina e eisteína, em concentrações suficientes para atender às necessidades do rato em crescimento. Os valores de PER que foram inferiores a 1,0, em todas as frações proteicas isoladas, elevaram-se para valores igual ou superior a 4,0, com a adição as dietas de 0,31 de DL-metionina e 0,21 de L-cisteína. A adição de igual porcentagem de cistefna e metionina ã dieta, contendo farinha integral com fonte de proteína, elevou o PER de 1,17 a 2,47 apenas. A principal causa do reduzido valor nutricional das proteínas do feijão Rosinha G2, além da deficiência em aminoácidos sulfurados, parece ser a baixa disponibilidade biológica da metionina que foi de 46% na farinha integral, 51% na fração globulina, 34% no isolado protéico total, 5,81 na fração albumina e 4,6% na proteína do resíduo insolúvel após extração da proteína. A adição dos inibidores isolados em dietas com 5 e 101 de caseína nas proporções de 0,6 e 1% da dieta, não alterou os índices de utilização da caseína, bem como, não produziu nenhum atraso no crescimento dos ratos. A adição a uma dieta com 101 de caseína de uma hemaglutinina isolada da fração albumina, produziu uma diminuição de 1% na digestibilidade e 12% no valor biológico da caseína, além de ter reduzido o crescimento a 2/3 em relação ao dos animais tomados como controle

Abstract: The main objectives of the work presented here were to isolate and study the composition and some physicochemical and nutritional properties of bean (Phaseolus vulgaris, L) protein from the variety "Rosinha G2". In the same study, the isolation, purification and partial characterization of...

Abstract: The main objectives of the work presented here were to isolate and study the composition and some physicochemical and nutritional properties of bean (Phaseolus vulgaris, L) protein from the variety "Rosinha G2". In the same study, the isolation, purification and partial characterization of the bean trypsin and chymotrypsin inhibitors were attempted. The extractability of the proteins was studied as a function of pH and ionic strength of the extracting media. Under acidic (pH < 3) or alkaline (pH > 8) conditions, 85 to 95% of the total integral flour nitrogen was extracted, Minimum extractability occured in the range of pH between 3.5 and 5.0. Two sequential extractions of the flour, first with distil led water , then with 0.5M NaCl solution, extracted around 80% of the total nitrogen.Sequential extractions of the same flour with various solvents revealed that 48! of the total nitrogen was extracted with distilled water, 25.6% with 0.5M NaCl solution. 19.31 with a sodium borate buffer (pH 10) containing 0.51 2-mercaptoetanol and O.SI lauryl sodium sulfate. Total extraction accounted for 9 2.81 of total nitrogen of the bean flour. Heating the soaked beans in boiling water (97 ºC) for various times indicated that 5 min of heating decreased the extractability of the proteins 50%, while 4 min of heating completely inactivated the trypsin and chymotrypsin inhibitors. Dialysis of a salt extract against distilled water caused the separation of the proteins into two fractions: solu ble in water (30%) and insoluble (70%). About 70-75¨% of the total nitrogen of the crude extract was recovered after dialvsis for 72 hours. Most of the trypsin and chymotrypsin inhibiting acti_ vities were associated with the water soluble (albumin)proteins. Heating the albumin solutions for 15 min at 97 ºC coagulated 65-70% of the proteins whereas the trypsin and chymotrypsin inhibitors remained in solution with full activity. The isolation and purification of the inhibitors from the non-coagulated fraction (97 ºC, 15 min) were accomplished by ammonium sulfate precipita tion (0.65 saturation), Sephadex G-50 ultrafiltration, cromato graphy on DEAE-cellulose and polyacrylamide gel electrophoresis. Final purification was 31 fold by comparison with the crude extract, All the isolated protein fractions contained carbohydrate in different proportions. A hydrolysate of he albumin fraction contained glucose, mannose, arabinose, galactose and xylose. The purified inhibitors contained 3.751. total carbohy- drate , represented by mannose, xylose and glucosamine. As to the amino acid composition, a common feature of the bean pro tein fractions was the very low methionine content. The albumin fraction showed a higher methionine content than the water inso luble protein fractions. The trypsin and chymotrypsin inhib^ tors isolate from the albumin fraction revealed high concentrations of cystine, serine, threonine and proline, in addition to aspartic and glutamic acids, On the other hand the concentrations of methionine, valine, leucine, tirosine and phenylalani ne were very low. Tryptophan and cysteine were totally absent from the inhibitors molecules. The combined ultracentrifugation and gel-filtration data permitted the calculation of the following parameters for the isolated inhibitors: molecular weight, 20,000; partial specific volume, 0.69; Stokes molecular radius, 20 A, diffusioncoefficient, 10.7 x 10-7 , and a frictional ratio of 1,14, Isoelectric focusing in polyacrylamide gel indicated the presence in the purified preparation of two protein compo nents with trypsin and chymotrypsin inhibiting power having iso electric points at pH's 5.1 and 6.0. Incubation of the inhibitors , first with trypsin and then with chymotrypsin or vice versa, suggested the existence in the inhibitor molecules of separate and independent binding sites for trypsin and for chymotrypsin. The inhibition of trypsin and of chymotrypsin in the presence of casein as subs trate was of the non-competitive type. The inhibition of tryp_ sin in the presence of benzoyl-DL-arginine p-nitroanilide (BAPNA) was of a mixed type. Human trypsin was inhibited by the isolated bean inhibitors 5.6 times more effectively than bovine trypsin. The inhibitors were very resistant to heat in water or in mildly acidic solutions; they were, however quickly inacti_ a 10% casein diet, decreased the casein digestibility by 71, the apparent biological value by 12%, and reduced the rat growth by 33%, as compared with the casein control diet

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