Orientador : Paulo Arruda

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O uso de produtos químicos para o controle de ervas daninhas é uma técnica bastante aplicada na agricultura. Para muitas culturas ainda não há um herbicida seletivo adequado, duas alternativas têm sido utilizadas para solucionar este problema. A primeira é o desenvolvimento de um herbicida...

Resumo: O uso de produtos químicos para o controle de ervas daninhas é uma técnica bastante aplicada na agricultura. Para muitas culturas ainda não há um herbicida seletivo adequado, duas alternativas têm sido utilizadas para solucionar este problema. A primeira é o desenvolvimento de um herbicida seletivo ou de uma nova formulação para um já existente. Esse processo, entretanto é prolongado e caro, pois o desenvolvimento de um produto novo requer testes sofisticados de milhares de compostos. A segunda alternativa é a seleção de plantas tolerantes a um determinado produto químico já existente, que possa ser utilizado como herbicida não seletivo. O estudo da tolerância ¿in vivo¿ para caracterização e isolamento dos produtos metabólicos de plantas inteiras, após a aplicação do herbicida, é dificultado, pois este sofre influência de várias funções fisiológicas (absorção, translocação, tempo, etc.) que devem ser considerados. Uma alternativa é a utilização de técnicas de cultura de células e tecidos, as quais possibilitam uma melhor identificação e seleção de genótipos tolerantes a herbicidas. Além disso, estas técnicas permitem o estudo de sistemas enzimáticos, fornecendo desta forma dados sobre o sítio primário de ação herbicida. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito de um herbicida não seletivo, o glifosato, em cultura de tecidos de milho. O glifosato tem sido largamente utilizado como um herbicida não seletivo. É rapidamente translocado nas plantas e é biodegradado por microrganismos do solo. Atua ao nível molecular através da inibição da biossíntese dos aminoácidos aromáticos, interferindo na atividade da enzima 5-enolpiruvil shiquimato 3-fosfato sintetase (EPSPs). Para o estudo do glifosato fora utilizados calos embriogênicos friáveis das linhagens de milho Cat100-1, Cat100-6 e TuxMo-1 (Banco de Germoplasma da UNICAMP. Depto. de Genética e Evolução). A escolha da concentração subletal do glifosato a ser utilizada para a seleção produziu um decréscimo na taxa de crescimento dos calos, entre 70-90%, quando submetidos a um gradiente de concentração de glifosato variando de 0 a 2,4 mM. De acordo com os resultados obtidos, os calos das linhagens Cat100-1, Cati00-6 e TuxMo-1 foram selecionados na concentração de 0,6; 2,4 e 0.3mM respectivamente. Foram realizadas 10 subculturas na presença das dosagens subletais para cada linhagem. Os calos selecionados bem como os controles foram submetidos a uma série de 10 subculturas na ausência de glifosato e a seguir foram novamente submetidos a um gradiente de concentração de glifosato variando de 0 a 4,8mM. Os calos selecionados e controles para cada linhagem apresentaram diferenças significativas com respeito à taxa de crescimento. A comparação do efeito de glifosato em calos embriogênicos friáveis das três linhagens de milho apresentou uma resposta de tolerância diferencial entre as linhagens estudadas, onde a linhagem Cat100-6 demonstrou uma maior tolerância nos testes utilizados e a linhagem TuxMo-1 foi a que apresentou uma maior redução no crescimento na presença do herbicida. Plântulas de milho das mesmas linhagens dos calos foram cultivadas em solução nutritiva contendo diferentes concentrações do herbicida glifosato. Considerando os parâmetros analisados (comprimento da radícula, peso seco da parte aérea e peso seco da raiz), verificou-se que a linhagem Cat100-6 é a mais tolerante ao herbicida glifosato do que as linhagens Cat100-1 e TuxMo-1, que apresentaram comportamento semelhante. Estes resultados demonstraram que a utilização da técnica de cultura de tecidos para a seleção ¿in vitro¿ de mutantes tolerantes ao glifosato mostrou ser eficiente na seleção de calos de milho. Os mesmos apresentaram uma boa repetibilidade na resposta ao herbicida quando plântulas das mesmas linhagens de calos foram submetidas ao tratamento com glifosato. Isto demonstrou que os dois sistemas são capazes de discriminar genótipos quanto suscetibilidade/tolerância ao glifosato. Foram realizados estudos quanto à capacidade de absorção do glifosato e também quanto às propriedades da enzima alvo (EPSPs). Calos controles e tolerantes de cada linhagem apresentaram uma rápida absorção do herbicida após uma hora de incubação em meio contendo glifosato-C, atingindo um pico a 1,5 horas, diminuindo em seguida. Os resultados obtidos sugerem que não houve alteração no mecanismo de absorção entre as subpopulações controle e tolerantes das três linhagens. A atividade da enzima alvo do glifosato, 5-enolpiruvil shiquimato 3-fosfato sintetase (EPSPs), foi determinada para as subpopulações controles e tolerantes das três linhagens de calos através do método de liberação de Pi e pelo método de Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Somente o método de HPLC demonstrou uma diferença da atividade específica da EPSPs de 2,08X para a subpopulação tolerante da linhagem Cat100-6. 1,4X para os calos tolerantes da linhagem TuxMo-1. Não foi observado diferenças na atividade da enzima entre os calos tolerantes e controles da linhagem Cat100-1. Com os resultados bioquímicos realizados não foi possível determinar com precisão o mecanismo de tolerância dos calos selecionados

Abstract: The use of chemical products for weed control is a widely employed technique in agriculture. In the case of many cultures there is not an adequate selective herbicide yet. However, there are two alternatives that can be used to solve this problem. The first one is the development of a...

Abstract: The use of chemical products for weed control is a widely employed technique in agriculture. In the case of many cultures there is not an adequate selective herbicide yet. However, there are two alternatives that can be used to solve this problem. The first one is the development of a selective herbicide or a new composition for a already existing herbicide, but this process takes a long time and is expensive since the development of a new products requires sophisticated tests of many compounds. The second alternative is the selection of plants that are tolerant to a certain already know chemical product that could be used as non-selective herbicide. The study of "in vivo" tolerance for characterization and isolation of metabolic products from whole plants, after the use of the herbicide, is difficult because of the influence of many physiological functions (absorption. translocation, time, etc.) that have be considered. One alternative is the use of tissue and cell culture techniques that allow the study of enzymatic system, which supplies information about primary target of the herbicide action. The objective of the present study is to gather data on the effect of non-selective herbicide, glyphosate, in maize tissue culture. Glyphosate has been largely employed as a non-selective herbicide. It is quickly translocated in the plants and is biodegradated by the soil microorganisms. It acts at the molecular level by the inhibition of the aromatic amino acids biosynthesis and interferes with the activity of the 5-enolpyruvil shikimate 3-phosphate synthase (EPSPs) enzyme. Friable embryogenic calli from the maize inbred line Cat100-1, Cat100-6 and tuxMo-1 were used in the study of the glyphosate effect. The maize inbred lines were obtained from the Maize Genetics Laboratory - UNICAMP. The sublethal concentration of the herbicide to be used for selection was determined as the one that permitted 70-90% gradient concentrations from 0 to 2,4 mM. According to the obtained results, calli from inbred lines Cat100-1, cat100-6 and TuxMo-1 were selected for the herbicide concentrations of 0,6, 2,4 and 0,3 mM respectively. Ten subcultures were done in the presence of sublethal dosages for each inbred line. The selected calli, as well as the controls, were submitted to a series of ten subcultures in the absence of glyphosate. Afterwards, they were submitted once again to a glyphosate gradient which concentration varied from 0 to 4.8 m. The selected calli and the controls of each inbred lines used. The inbred line Cat100-6 was the most tolerant one and the inbred line TuxMo-1 was the one that presented the biggest growth reduction in the herbicide presence. Maize seedlings from Cat100-1, Cat100-6 and TuxMo-1 were cultivated in nutritive solution containing different glyphosate concentrations. Considering the analysed parameters (root length, root dry weight and leaves dry weight), it was observed that the inbred line Cat100-6 is the more tolerant to glyphosate than the inbred lines Cat100-1 and TuxMo-1, which showed similar behavior. These results demonstrated that the use of tissue culture techniques for the ¿in vitro¿ selection of glyphosate tolerant mutants is efficient for the selection of maize calli. The maize calli showed a good repetitiveness response to the herbicide when seedlings of the same inbred lines as the calli were submitted to glyphosate treatment. This results demonstrated that the differences found among the inbred lines should be due to genetic: factors. Studies regarding the glyphosate absorption capacity and the EPSP synthase target enzyme properties were performed. Control and tolerant calli from each line presented a rapid herbicide absorption after one hour of incubation in medium containing glyphosate - C. The peak was achieved within one hou and a half, falling afterwards. This behavior was observed for the inbred lines (controI and tolerant calli). The results showed that there was no alteration in the absorption mecanism among the control and tolerant subpopulations of the three inbred lines. The activity of the glyphosate target enzyme EPSP synthase was determined for the control and tolerant subpopulations of the three inbred lines. The methods used were Pi liberation and HPLC. Only the HPLC method showed a difference in the EPSP synthase activity of 2.08x for the tolerant subpopulation of the inbred line Cat100-6 and of 1.4x for the tolerant calli of the inbred line TuxMo-1. It was not observed differences in the enzyme activity fot the tolerant and control calli of the inbred line Cat100-1. Biochemical studies did not determine with precision the tolerance mecanism of the selected calli