Orientador : Sonia Presa Caggiani de Salzberg

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: O principal objetivo deste trabalho foi a produção, purificação e obtenção de anti-soro da enterotoxina estafilocócica tipo B (EEB). Com os reagentes obtidos (antígeno e anticorpo) procedeu-se ao levantamento de S. aureus produtores de enterotoxina B em portadores assintomáticos. A...

Resumo: O principal objetivo deste trabalho foi a produção, purificação e obtenção de anti-soro da enterotoxina estafilocócica tipo B (EEB). Com os reagentes obtidos (antígeno e anticorpo) procedeu-se ao levantamento de S. aureus produtores de enterotoxina B em portadores assintomáticos. A enterotoxina foi produzida pela linhagem S. aureus S-6, conhecida como altamente produtora de EEB. O método de purificação foi o de SCHANTZ e colaboradores, e para a produção de anti-soro, utilizou-se o esquema de imunização de coelhos, otimizado pelo Food Research Institute (FRI), Wisconsin, USA. O processo de purificação foi avaliado pela difusão dupla em gel "Optimal Sensitivity Plate", OSP (Ouchterlony modificado) para a identificação da toxina, o método de difusão simples em gel de "Oudin" para a dosagem da toxina, e a dosagem de proteína total foi realizada pelo método de Lowry. Na produção de toxina foi utilizado como meio de cultura o hidrolisado de caseína N-Z-Amine NAK suplementado com tiamina (0,00005%) e niacina (0,001%). A quantidade de toxina produzida neste meio foi de 0,33mg/mL. Na primeira cromatografia em Amberlite CG-50 obteve-se um rendimento de 79,9% em relação à quantidade total adsorvida, na segunda cromatografia em Amberlite CG-50 obteve-se um rendimento de 73,3% em relação à primeira cromatografia e na terceira cromatografia em carboximetil celulose o rendimento foi de 80% era relação à segunda cromatografia. O rendimento através de todo o processo de purificação, ou seja toxina total produzida no meio de cultura e toxina total após a terceira cromatografia foi de 44,2%. A toxina purificada apresentou um alto grau de pureza já que houve formação de apenas uma linha de precipitação quando ensaiada contra anti-soro polivalente. Para a produção de anti-soro utilizou-se um lote de cinco coelhos, sendo um inoculado com toxina bruta, sem purificar e quatro com toxina purificada. Para a inoculação seguiu-se o esquema de imunização utilizado no FRI, que abrange um período de 70 dias e doses compreendidas entre 1 e 300 µg administradas em oito seções. O soro foi retirado entre uma e oito semanas após a última injeção através de punção cardíaca. O soro do animal imunizado com preparação bruta de enterotoxina apresentou, através do método de ÜSP, maior variedade de anticorpos, evidenciados através das linhas de precipitação formadas, que os soros dos animais inoculados com enterotoxina purificada. Estes últimos apresentaram ainda alguns interferentes, porém as linhas de precipitação correspondentes foram tênues em relação à linha principal de enterotoxina B. O número de portadores humanos assintomáticos de S. aureus 53% está dentro dos valores apresentados na literatura, 18 a 82%. O valor encontrado para as linhagens produtoras de enterotoxina B, 70,8%, foi ligeiramente superior aos valores apresentados na literatura norte americana

Abstract: The principal goal of this work was the production, purification and antiserum production of Staphylococcal enterotoxin B (SEB). With these reagents, antigen and antiserum, a survey of enterotoxin B producing S. aureus strains in assintomatic carriers was conducted. The enterotoxin was...

Abstract: The principal goal of this work was the production, purification and antiserum production of Staphylococcal enterotoxin B (SEB). With these reagents, antigen and antiserum, a survey of enterotoxin B producing S. aureus strains in assintomatic carriers was conducted. The enterotoxin was produced by the S-6 strain of S. aureus, a well-known enterotoxin B producer. The purification procedure was that of SCHANTZ and co-workers and for the antiserum production, the Food Research Institute (FRI), Wisconsin, USA immunization schedule was followed. The purification procedure was monitored through the Lowry method for total protein, double diffusion in gel Optimal Sensitivity Plate, OSP (a double diffusion Ouchterlony modification) for toxin identification and single gel diffusion of Oudin for toxin quantification. The casein hydrolysate N-Z-Amine NAK supplemented with thiamine (0,00005%) and niacin (0,001%) was used for toxin production. The enterotoxin concentration in the supernatant was 0,33mg/mL. The toxin yield in the first chromatography using the resin Amberlite CG-50 was 79,9% of the total adsorbed in the resin. In the second chromatography, using the same resin, the yield was 73,3% with respect to the first chromatography and in the third chromatography, using Carboximethyl Celulose; the yield was 80% with respect to the second chromatography. The yield for the entire purification procedure, total toxin after the third chromatography and and total toxin in the broth culture, was 44,2%. The purified enterotoxin showed high purity since only one precipitin line was formed against polivalent antiserum. Five animals were used for the antiserum production, one inoculated with the crude toxin and four with the purified toxin. For inoculation, the FRI recommended schedule was used, with doses ranging between 1 and 300 µg given in eight different sections during a 70 day period. The animals were bled through cardiac puncture after one to eight weeks following the last injection. The antisera obtained from the crude extract immunized animals showed higher number of antibodies, by the OSP method as displayed through precipitin lines, than the antisera from rabbits inoculated with the purified toxin, the latter showed a few very weak secondary lines related to the main line due to enterotoxin B. The number of S. aureus assyntomatic carriers 53% was within the range of values found in the literature, between 18 to 82%. Among them, the number of enterotoxin B producers 70,8% was slightly higher than the 68% reported by North American literature