Orientador: Octavio Henrique de Oliveira Pavan

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Este trabalho objetivou a padronização de técnicas visando a caracterlzação de proteínas do Vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs). Várias metodologias de purificação foram testadas para oVGDs, até a definição do padrão ideal a ser seguido, para se obter o vírus livre de...

Resumo: Este trabalho objetivou a padronização de técnicas visando a caracterlzação de proteínas do Vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs). Várias metodologias de purificação foram testadas para oVGDs, até a definição do padrão ideal a ser seguido, para se obter o vírus livre de contaminantes. Algumas variações experimentadas mostraram-se ineficientes, pois não oi obtido o vírus puro. A purificação do VGDs através de centrifugação diferencial apresentou, como contaminantes, restos de tecidos e células de lagartas e, algumas vezes, bactérias.O emprego de triton X-100, como detergente, fez com que a cápsula protéica do VGDs se solubiliasse durante os passos de sua purificação. O esquema de purificação que se mostrou mais eficiente foi aquele em que o macerado de lagartas passou por um ciclo de centrifugação diferencial, seguida de centrifugação em colchão e gradiente de sacarose e, neste último, coletando-se a banda mais próxima à concentração de 58 %. A observação das amostras de VGDs em microscópio eletrônico mostrou que estas, quando ressuspendidas em tampão Tris-HCI 0,1 M pH 7,8, apresentavam as partículas virais agregadas, e separadas e nítidas quando ressuspendidas em água destilada. O emprego de soluções alcalinas na solubilização da cápsula protéica do VGDs não apresentou o resultado esperado, ou seja, a obtenção da granulina. Mesmo variando-se o tempo e a temperatura de lncubação das amostras, a concentração de proteínas apresentou-se sempre muito baixa.A solubilização do VGDs com TCA apresentou uma concentração de proteínas maior, possibilitando o reconhecimento da granulina, quando as amostras foram corridas em eletroforese. Foi testada a solubilização com TCA em vírus que já tinham o peso molecular de suas respectivas proteínas da matriz conhecido através de solubilização alcalina (VPNAc, VPNAg, VPNHz e VPNTn). Houve uma pequena variação que não pode ser atribuída ao método de obtenção destas, e sim à variabilidade de metodologias empregadas em eletroforese. Dessa forma, pode-se concluir que com o emprego de TCA é possível obter-se as proteínas do vírus e também determinar o seus pesos moleculares. Em relação à metodologia de eletroforese, a que mostrou melhor resolução foi a de poliacrilamida e SDS sem o emprego de uréia. Através da análise de padrões eletroforéticos pode-se obter um padrão das proteínas do VGDs apresentando a granulina como principal componente com um peso molecular de 31500 d

Abstract: This study aimed a padronization of methodology envisaging the characterization of the proteins of the Diatrea saccharalis Granulosis Vírus (DsGV). Several methodologies for the purification of DeGV were tested, to obtain vírus free of contaminants. Some variations in the protocol...

Abstract: This study aimed a padronization of methodology envisaging the characterization of the proteins of the Diatrea saccharalis Granulosis Vírus (DsGV). Several methodologies for the purification of DeGV were tested, to obtain vírus free of contaminants. Some variations in the protocol experimented were not efficient resulting in contaminated preparatlons. The purification of DsGV through differential centrifugation showed tissue and cells debris and bacteria as contaminants. The use of triton X-100 as detergent solubilized the proteic capsule of DsGV during the purification steps. The most effective metodologiy for purification was the homogenization of larvae followed by a cicle of differential centrifugation and by centrifugation in a sucrose cushion and gradient. The vírus band is found at the sucrose concentration of 58 %. The observation of the DsGV samples in eletron microscope showed that the samples in Tris-HCI buffers formed bundles wich were not formed when the samples where mantained in water. The use of alkaline solutions to dissolve the proteic capsule of DsGV did not presented the expected results in different Incubation times and temperatures resulting in all cases in lows concentration of the proteins. Better results were obtained with TCA which results in much higher yelds of total protein. To evaluate the method, a series of other baculoviruses were treated with TCA and the resulting protein profiles compared to those obtained by other authors using the alkaline treatment. The results were very similar showing that the method is a viable alternative procedure. The electrophoresis metodology showing the best resolution of the proteins was that with polyacrilamide and SDS without urea. The eletrophoretic profile of DsGV proteins has been obtained and the main component can be identifired as granulin having a molecular weight of 31500 d