Resumo: A adesão anormal das células brancas e vermelhas ao endotélio, que desencadeia numa diminuição do fluxo de sangue na microcirculação, é um dos principais fatores envolvidos na iniciação da vaso-oclusão em pacientes falciformes (AF). O estado inflamatório crônico, característico nos pacientes com AF, eleva a circulação de citocinas, as quais podem contribuir significativamente para a ativação e adesão das células vermelhas e brancas ao endotélio. O óxido nítrico (NO) e a via de sinalização dependente em NO têm importante efeito inibidor nas propriedades adesivas de leucócitos. Drogas que aumentem a biodisponibilidade de NO ou que atuem na via de sinalização NO-GMPc podem ser benéficas no tratamento de alguns aspectos da AF. Já é de conhecimento que pacientes com AF apresentam níveis elevados de algumas citocinas presentes no plasma, assim sendo, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos in vitro das citocinas nas propriedades adesivas de neutrófilos e células vermelhas de indivíduos controles e pacientes com AF. Adicionalmente, foram determinados os efeitos de BAY 73-6691, um inibidor da enzima hidrolizante de GMPc, fosfodiesterase 9A (PDE9A) e BAY 41-2272, um ativador de guanilato ciclase, na ausência ou presença da estimulação pelas citocinas na adesão dessas células. Os neutrófilos e as células vermelhas de indivíduos controles e pacientes com AF foram isolados de sangue periférico. A adesão das células à fibronectina foi determinada utilizando o ensaio de adesão estático na presença ou ausência das citocinas IL-8 (10-500ng/ml), TNF-alpha (10-100ng/ml) e GM-CSF (0,1-10ng/ml) e/ou na presença/ausência de BAY 73-6691 (60µM), BAY 41-2272 (60nM) ou DMSO como veículo (0.2%v/v). Como previamente demonstrado, os neutrófilos de pacientes com AF (neutrófilos AF) possuem uma maior capacidade de aderir à FN do que os neutrófilos de indivíduos controle (neutrófilos CON). A estimulação das células in vitro com as três citocinas aumentaram significativamente as adesões à FN dos neutrófilos CON e aumentou ainda mais a adesão dos neutrófilos AF. A incubação de ambos os neutrófilos, CON e AF, com BAY 73-6691, mas não BAY 41-2272, reduziu significativamente as propriedades adesivas à FN; esse evento foi acompanhado por uma diminuição da expressão das moléculas de adesão, L-selectina e CD11b (subunidade Mac-1) na superfície de neutrófilos AF. Além do mais, nas concentrações utilizadas, BAY 73-6691, mas não o BAY 41-2272, diminui significativamente a adesão de neutrófilos CON e AF após estimulação com IL-8, TNF-a e GM-CSF. No entanto, esse evento não foi acompanhado por alterações na expressão da moléculas de adesão na superfície de neutrófilos AF quando estimulados com IL-8. As células vermelhas de indivíduos AF também apresentaram uma maior capacidade de se aderir à FN quando comparadas às células de indivíduos controles. No entanto, ao contrário dos neutrófilos, na presença de IL-8 (10-500ng/ml) e TNF-a (0.1-1µg/ml), não houve alteração das propriedades adesivas dessas células tanto de indivíduos controles quanto das células de pacientes com AF. Além disso, BAY 73-6691 e BAY 41-2272, não alteraram a adesão basal tanto das células vermelhas de controles quanto pacientes com AF. Os principais mediadores inflamatórios, utilizados em concentrações fisiologicamente relevantes, foram capazes de aumentar as propriedades adesivas de neutrófilos, mas não das células vermelhas, de indivíduos controles e AF. Portanto, sugerimos que as citocinas inflamatórias circulantes podem desempenhar um papel na indução das propriedades adesivas dos neutrófilos em pacientes falciformes; em contrapartida, outros fatores além do estímulo inflamatório, podem ser mais importante para induzir a adesão das células vermelhas de pacientes AF. Dados sugerem que agentes que aumentam os níveis de GMPc intracelular podem ser úteis para reduzir as propriedades adesivas de neutrófilos AF, mesmo na presença de um estado inflamatório. PDE9A é altamente expressa pelas células hematopoiéticas e a inibição desta enzima, com conseqüente elevação de GMPc, pode representar um alvo terapêutico para drogas que são tecido/célula específicas, necessitando de mais estudos in vivo e in vitro para a terapêutica de AF Ver menos

Abstract: The adhesion of both red and white cells to the vessel walls of the microcirculation initiates vaso-occlusion in sickle cell disease (SCD). The chronic inflammatory nature of SCD leads to elevation of circulating cytokines in patients, which may contribute significantly to the activation of red and white cells and their consequent adhesion. Nitric oxide (NO) and the NO-dependent signaling pathway have important inhibitory effects on cellular adhesive properties. Drugs that enhance NO bioavailability or NO-cGMP-dependent signaling may hold potential for treatment of various aspects of SCD. It is known that levels of certain cytokines are augmented in the plasma of SCD individuals; therefore, this study aimed to observe the effect of cytokines, on the in vitro adhesive properties of neutrophils (neu) and red blood cells (RBC) from healthy control (CON) and steady-state SCD (SCD) individuals. Furthermore, the effects of BAY 73-6691, an inhibitor of the cGMP-hydrolyzing enzyme, phosphodiesterase 9A (PDE9A) and BAY 41-2272, a guanylate cylase activator, on non-stimulated and cytokine-stimulated cell adhesion were determined. Neutrophils and red blood cells (RBC) were isolated from the peripheral blood of CON and SCD individuals. Cell adhesion to immobilized fibronectin was assessed using static adhesion assays in the presence or absence of the cytokines, IL-8 (10-500ng/ml), TNF-alpha (10-100ng/ml) and GM-CSF (0,1-10ng/ml) and/or in the presence/absence of BAY 73-6691 (10-60µM), BAY 41-2272 (60nM) or DMSO vehicle (0.2%v/v). As previously demonstrated, SCDneu have a greater capacity to adhere to FN than CONneu. Stimulation of cells in vitro with all three cytokines significantly augmented both CONneu adhesion to FN and further increased SCDneu adhesion. The incubation of both CONneu and SCDneu with BAY 73-6691, but not BAY 41-2272, significantly reduced their adhesions to FN; this was accompanied by a decrease in the expressions of the L-selectin and CD11b (Mac-1-subunit) adhesion molecules on the SCAneu surface. Furthermore, BAY 73-6691, but essentially not BAY 41-2272, significantly inhibited CONneu and SCDneu adhesion stimulated by IL-8, TNF-alpha and GM-CSF. However, this was not accompanied by alterations in adhesion molecule presentation on IL-8-stimulated SCAneu. As previously reported, SCD RBC have a greater capacity to adhere to FN, in vitro, compared to CON RBC. However, in contrast to neutrophils, cytokines IL-8 (10-500ng/ml) and TNF-alpha (0.1-1µg/ml) did not alter the capacities of neither CON RBC nor SCD RBC to adhere to FN. Furthermore, BAY 73-6691 and BAY 41-2272 did not affect either basal CON RBC or SCD RBC adhesion. Key SCD inflammatory mediators were found, at physiologically relevant concentrations, to augment the adhesive properties of neutrophils from control and SCD individuals. Circulating inflammatory cytokines may play a role in the induction of leukocyte adhesive properties in SCD; in contrast factors other than inflammatory stimuli may be more important for induction of SCD RBC adhesion. Data suggest that elevation of intracellular cGMP may be an important approach for reducing SCD leukocyte adhesive properties, even in an inflammatory environment. PDE9A is highly expressed in hematopoietic cells and inhibition of this enzyme, with consequent augmentation of cGMP, may represent a tissue/cell-specific therapeutic drug target worthy of further in vitro and in vivo studies as a therapy for SCD Ver menos