Orientador : Benedito de Oliveira

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Urina de paciente da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, com quadro clínico de gamopatia monoclonal tipo mieloma múltiplo e apresentando proteinúria de Bence Jones caracte-rística, foi purificada através de diálise exaustiva seguida de cromatografia de troca iônica. Seu grau de pureza...

Resumo: Urina de paciente da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, com quadro clínico de gamopatia monoclonal tipo mieloma múltiplo e apresentando proteinúria de Bence Jones caracte-rística, foi purificada através de diálise exaustiva seguida de cromatografia de troca iônica. Seu grau de pureza foi ava-liado através de imunodifusão em gel de agar, imunoeletrofore-se em agarose e eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. Através de anti-soro específico a proteína de Bence Jones JJO foi tipada sorologicamente como pertencente ao tipo antigênico ?. A composição global de aminoácidos da proteína de Bence Jones JJO mostrou: a) a presença de cinco meias cistinas. b)presença de um resíduo de metionina. c) numero total de resíduo (excluindo triptofano) igual a 206, d) um padrão de re-síduos compatível com as proteínas de Bence Jones descritas. O pentapeptideo radioativo Plde seqüência de aminoácidos Pro-Thr-Glu-Cys-Ser, isolado de autoradiografia do di-gesto peptico-tríptico da proteína BJP (JJO) reduzida e alqui-lada, tipifica quimicamente JJO corno uma proteína do isotipo lambda. O isolamento e caracterização do peptídeo Tl de seqüência Thr-Val-Ala-Pro-Thr-Glu-Cys-Ser e que compreende a re-gião C-terminal da cadeia, confirma a tipificação química de BJP (JJO) como uma proteína ?. A evidência obtida de PAGE/SDS de que após redução, a proteína de Bence Jones JJO migra como uma única banda de mes-ma mobilidade de cadeias leves de imunoglobu1inas monoc1onais reduzidas, permite caracterizar seu arranjo como dimêrico. O isolamento e caracterização do tripeptídeo Ser-His--Arg, permite classificar a proteína JJO como Oz(-) em relação a expressão desta variante sorológica (Arg 190).O pentapeptideo denominado T5 (Gln-Ser-Asn-Asn-Lys), Onde está inserida a posição 171 correlacionada com a expressão da variante Mz, permite caracterizar parcialmente JJO como uma proteína Mz(-}.O peptídeo Ala-Ala-Pro-Ser-Val-Thr-Leu-Phe-Pro-Pro-Ser-_Ser-Glu-Glu-Leu-Glu-Ala-Ser-Lys, obtido de mapeamento diagonal, compreende a região delimitada pelos resíduos 111 a 129 do domínio C ?, onde estão localizadas duas das três posições características da variante Mcg. A presença de alanina na po-sição 112 e serina na posição 114 caracterizam parcialmente a proteína JJO como Mcg(-). O peptídeo Ala-Gly-Va1-Glu-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Lys permite caracterizar a proteína de Bence Jones JJO como uma proteína Way{-), uma vez que alanina foi o resíduo presente na posi-ção 157. Treonina na posição 163 caracteriza a terceira posição envolvida na expressão da variante Mcg e conseqüentemente permite classificar JJO como uma cadeia leve Mcg(-). A sequência de aminoãcidos determinada para o peptídeo Ser-Tyr-Ser-Cys-G1n-Va1-Thr-His-G1u-Gly-Ser-Thr-Va1-Gly-Lys, permite caracterizá-lo como o peptídeo de região constante de cadeia leve do isotipo 1ambda que compreende os resíduos 191 a 205 e que contém um dos resíduos de cisteína da ponte disu1fe-to intradomínio C?. As informações conseguidas através da identificação das variantes não a1élicas de região C ? da proteína JJO poderiam sugerir dois arranjos possíveis dentro dos oito descritos (FETT & DEUTSCH, 1976): Oz(-) Kern(+) (Mcg(-) Weir(-) Ev(-} Way(-) Mz(-) ou Oz(-) Kern(-) Mcg(-) Weir(-) Ev(-) Way(-) (Mz(-). Estes dois arranjos poderiam corresponder à codificação das duas sequências Oz- Kern- é Oz- Kern+ dentre as quatro formas não a1é1icas da região C ? descritas (HIETER et a1., 1981).A presença de tirosina determinada como resíduo-N-termina1 através da técnica de dinitrofenilação, permite c1assificar a proteína BJP (JJO) como pertencente ao subgrupo V?III.. A composição de aminoácidos (Leu, G1y, Asp, Lys) obtida a partir de e1uição do material contido na mancha Tv2 bem como a determinação de 1eucina na posição N-terminal, poderia sugerir relação de homologia com o segmento 28 ? 31 da região de hipervariabi1idade CDR1 da proteína X (MILSTEIN, 1968) per-tencente ao subgrupo de região variável VÀIII (KABAT, 1979).O peptídeo Tv1 de composição Thr, Glx, Pro, G1y, Leu2 Val, Lys não foi localizado por homologia nas regiões CDR e FR de nenhum dos seis subgrupos de região variável descritos(KABAT, 1979), o que indicaria a possibilidade de se tratar de um pép-tideo de região determinante de complementariedade da proteína JJO. De imunização de coelhos com a proteína de Bence Jones JJO purificada, foi obtido anti-soro anti-cadeia ? humana. Este anti-soro não revelou proteínas do isotipo kappa, o que atesta sua especificidade

Abstract: Urine of a patient (J.J.O.) with osteolytic neoplasia characteristic of multiple myeloma was obtained from the School of Medicine. Universidade Estadual de Campinas. Through the qualitative heat test it was detected a Bence Jones proteinuria. Urine JJO was exhaustively dialyzed against...

Abstract: Urine of a patient (J.J.O.) with osteolytic neoplasia characteristic of multiple myeloma was obtained from the School of Medicine. Universidade Estadual de Campinas. Through the qualitative heat test it was detected a Bence Jones proteinuria. Urine JJO was exhaustively dialyzed against deionized water and purified by anion exchange on chromatography. Bence Jones protein JJO was serologically typed as ? and its dimeric configuration shown by SDS polyacrylamide electrophoresis gel The amino acid composition of protein JJO showed: a) 5 moles of half-cystine/mole of protein (which is in agreement with the evidence of dimeric form); b) 1 mole of methionine/ mole of protein; c) total number of residues estimated in 206(not including tryptophane) and d) results similar to the data avaiable for other proteins of this type. Chemical typing was achieved by the isolation of the radioactive C-terminal Pro-Thr-Glu-*CMCys-Ser pentapeptide characteristic of ? type L chains; these data are in agreement with the serological typing. The tryptic Tl octapeptide (Thr-Val-Ala-Pro-Thr-Glu-Cys- Ser) corroborates the chemical typing of JJO as a ? Bence Jones protein. The tryptic T3 peptide (Ser-His-Arg), obtained from peptide mapping, supports the .characterization of JJO as a 190 Arg Oz{-) lambda chain. The iso1ation of the Gln-Ser-Asn-Asn-Lys pentapeptide from peptide mapping allows the partial characterization of JJO as far as position 171 is concerned. The assignement to the Mcg variant was accomplished by the isolation of the peptide Ala-A1a-Pío-S_r-Val-Thr-Leu-Phe- Pro-Pro-Ser-Ser-G1u-Glu-Leu-Glu-Ala-Ser-Lys,' which includes two of the three positions involved in the expression of this variant. The detection of Ala 112 and Ser 114 provides evidence of the partial characterization of JJO as an Mcg (-) L chain. The peptide Ala-Gly-Va1-G1u-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Lys obtained from the neutral region of diagona1 mapping the presence of alanine tn position 157, allowing the showed classi-fication of JJO as a Way(-) variant. The parcial characteri-zation of BJP (JJO) as Mcg(-) was confirmed by the presence of threonine in position 163 in this peptide. One of the half-cystines involved in the C ? intradomain disulphide bridge was detected through the isolation of the tryptic T2 peptide (Ser-Tyr-Ser-Cys-Gln-Val-Thr-His-Glu-Gly-Ser-Thr-Val-Gly-Lys).Based on the information concerning the study of the C domain of the ? protein JJO and the eight types of C ? Domains proposed by FETT & DEUTSCH (l976), one of the following ar-rangements is suggested: Oz(-) Kern(+) Mcg(-) Weir(-) Ev(-) Way(-) Mz(-) or Oz(-) Kern{-) Mcg(-)Weir(-} Ev(-) Way(-) Mz(-)