Analise do efeito da dexametasona, acido retinoico e ergocalciferol na atividade transcricional da região promotora do gene PAX9 humano
Liza Lima Ramenzoni
TESE
Português
T/UNICAMP R144a
[Transcriptional activity analysis of promoter region of human PAX9 gene under retinoic acid, dexamethasone and ergocalciferol treatment in MCF-7 and MDPC23 cells]
Piracicaba, SP : [s.n.], 2009.
42 f. : il.
Orientador: Sergio Roberto Peres Line
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Resumo: O gene PAX9, pertencente à família Pax, é amplamente expresso em vários tecidos craniofaciais durante o desenvolvimento. Sabe-se que mutações neste gene em humanos causam fenótipo de oligodontia, afetando os dentes molares e segundos pré-molares. Grande variedade de agentes fisiológicos e...
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Resumo: O gene PAX9, pertencente à família Pax, é amplamente expresso em vários tecidos craniofaciais durante o desenvolvimento. Sabe-se que mutações neste gene em humanos causam fenótipo de oligodontia, afetando os dentes molares e segundos pré-molares. Grande variedade de agentes fisiológicos e farmacológicos externos podem ter impacto relevante na regulação da atividade transcricional de genes modulando fatores de transcrição. A presente tese focaliza o estudo da região 5'do gene PAX9 humano e tem como objetivo analisar a influência da dexametasona, ácido retinóico e ergocalciferol (vitamina D2) na atividade transcricional de sua região promotora, utilizando construções em vetor plasmideano que dirige a transcrição do gene da luciferase de vagalume (Photinus pyralis, pGL3 basic vector). Para ensaios de transcrição, foram amplificados através de ensaios com transcriptase reversa, transcritos do gene PAX9 de células mamárias de adenocarcinoma MCF-7 e células odontoblastóides de camundongo MDPC23. Estes transcritos foram quantificados através de PCR quantitativo. Fragmentos da região promotora do gene PAX9 humano de 1198pb (-1106 - +92), 843pb (-751- +92) e 691bp (-1106 - +92 com deleção de 507pb nos sítios -645 e -138) foram recombinados com vetor de expressão pGL3Basic e denominados PAX9-pGL3B1, PAX9-pGL3B2 e PAX9-pGL3B3, respectivamente. As contruções foram transfectadas em cultura de células mamárias de adenocarcinoma MCF-7 e células odontoblastóides de camundongo MDPC23. Todas as placas de cultura foram submetidas à ação de três drogas: dexametasona (DEX), ácido retinóico (RE) e ergocalciferol (VITD2). Após lise das células, os níveis relativos de expressão da proteína luciferase foram analisados com o uso do kit Dual-Glo Luciferase em luminômetro. Os resultados referentes às células mamárias de adenocarcinoma MCF-7 mostraram que: 1) Altas concentrações de ácido retinóico aumentaram a síntese de RNA mensageiro transcrito. 2) Fragmentos do promotor PAX9 de 1198pb (PAX9-pGL3B1) e 843pb (PAX9-pGL3B2) foram ativados na presença de ácido retinóico mas suas transcrições desestimuladas na presença da dexametasona e ergocalciferol. 3) A atividade da luciferase na construção PAX9-pGL3B2 foi mais fraca que outras duas construções, indicando que a sequência -1106 and -751 ou 355pb era importante para a atividade transcricional. 4) Fragmento do promotor clivado nos sítios -645 e -138 com deleção de 507pb (PAX9-pGL3B3) foi ativado negativamente somente na presença do ergocaciferol, enquanto que com a dexametasona e ácido retinóico o mesmo não foi afetado. Quanto às células odontoblastóides de camundongo MDPC23, os resultados mostraram que: 1) Todas as concentrações de ergocalciferol influenciaram positivamente a síntese de RNA mensageiro transcrito. 2) A atividade promotora das construções PAX9-pGL3B1 e PAX9-pGL3B2 foi aumentada com baixa concentração de dexametasona e ergocaciferol enquanto que alta concentração diminuiu esta atividade. 3) Na construção PAX9-pGL3B3, todas concentrações de ergocaciferol influenciaram a transcrição do promotor negativamente, enquanto que com a dexametasona e ácido retinóico, a mesma não foi afetada. Concluímos que as drogas dexametasona, ácido retinóico e ergocalciferol podem modular a expressão do gene PAX9. A região de 507pb deletada do promotor do gene PAX9 humano pode conter sítios de ligação para receptores do ácido retinóico e dexametasona.
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Abstract: PAX9, member of the family homeobox, has important functions in embryogenesis and it is widely expressed in various craniofacial tissues during development. PAX9 mutations in human families cause autosomal dominant oligodontia, characterized by the absence of permanent molars and...
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Abstract: PAX9, member of the family homeobox, has important functions in embryogenesis and it is widely expressed in various craniofacial tissues during development. PAX9 mutations in human families cause autosomal dominant oligodontia, characterized by the absence of permanent molars and pre-molars. A great variety of physiological or pharmacological environmental factors may have impact on downstream signaling cascades and transcriptional regulation of gene modulating transcription factors. This work focused on the analysis on the 5'-flanking region of the PAX9 gene studying the influence of retinoic acid, dexamethasone and vitamin D on the expression of PAX9 by expression constructs that carry the reporter gene luciferase (Photinus pyralis, pGL3 basic vector). In the present study, we have PCR amplified cDNAs encoding mouse Pax9 from Mouse Odontoblast Cell-Like-23 (MDPC23) and PAX9 from Human breast adenocarcinoma (MCF-7) and quantified by Quantitative PCR. We examined the transcriptional activity of human PAX9 promoter from constructions: 1) PAX9-pGL3B1 construct clone PAX9 gene promoter 1198bp from -1106 upstream to +92 downstream of translation start site (ATG). 2) PAX9-pGL3B2 construct clone PAX9 gene promoter 843bp from -751 upstream of translation start site (ATG) to +92 downstream of translation start site (ATG). 3) PAX9-pGLB3 construct clone PAX9 gene promoter 691bp from -1106 upstream of translation start site (ATG) to +92 downstream of translation start site (ATG) using deletion of 507bp in restriction sites (-645 and -138) of ApaI enzyme. These constructions were transfected into Mouse Odontoblast Cell-Like-23 (MDPC23) and PAX9 from Human breast adenocarcinoma (MCF-7). Cell cultures were all submitted to selective regulation of tree drugs: dexamethasone (DEX), retinoic acid (RE) and ergocalciferol (VITD2). Relative luciferase expression units were obtained by dual luciferase assay kit. The results in Human breast adenocarcinoma (MCF-7) showed that retinoic acid and dexamethasone influenced negatively the expression of PAX9 promoter. PAX9-pGL3B1 and PAX9-pGL3B2 promoter was inhibited under the treatment of dexamethasone and ergocalciferol. Retinoic acid and dexamethasone did not altered PAX9-pGL3B3 (-1106 to +92, 507bp deleted with ApaI digest) behavior. Luciferase activity in plasmid PAX9-pGL3B2 was always weaker than the other two constructions indicating that sequence present between -1106 and -751 or 355bb were important for the transcriptional activity of PAX9 promoter. The results in Mouse Odontoblast Cell-Like-23 (MDPC23) showed that it PAX9-pGL3B1 and PAX9-pGL3B2 promoter activity was increased by the treatment of lower concentration of dexamethasone and ergocalciferol, whereas higher concentration of the same drugs decreased this activity. The effect of the retinoic acid in the luciferase activity of PAX9-pGL3B1 has the same pattern but for the PAX9-pGL3B2, all concentrations increased the promoter activity. For the PAX9-pGL3B3 construction, concentrations of ergocalciferol had a statistically significance decreasing the activity of the promoter and no effect of the activity was observed in the dexamethasone and retinoic acid treatment. In conclusion, dexamethasone, retinoic acid and ergocalciferol may bind to PAX9 gene promoter and up or down-regulate PAX9 transcriptional activity. A 507bp region (-645 and -138) within PAX9 promoter may harbor biding sites for dexamethasone and retinoic acid since none of concentrations of these reagents influenced changes in promoter activity.
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Line, Sergio Roberto Peres, 1963-
Orientador
Scarel-Caminaga, Raquel Mantuaneli
Avaliador
Santos, Maria Cristina Leme Godoy dos
Avaliador
Saito, Daniel, 1974-
Avaliador
de Souza, Ana Paula, 1975-
Avaliador
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Liza Lima Ramenzoni
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