Resumo: Moniliophthora perniciosa é um basidiomiceto hemibiotrófico patogênico ao cacaueiro e outras espécies vegetais. Sua ação na planta consiste em provocar superbrotamentos, epinastia, hiperplasia e, por fim, necrose de tecidos, que passam a ser a matéria prima para a produção de seus esporos, no interior de estruturas chamadas basidiomatas. A proposta deste trabalho foi entender como o fungo se prepara para a produção de basidiomatas e que genes podem estar relacionados a esse processo. Para isso, foram feitas análises morfológicas do micélio anterior à emergência de basidiomatas com o auxílio de estereomicroscopia, microscopia de luz e microscopia de varredura. As modificações apresentadas pelo micélio antes de sua frutificação mostram um comportamento similar ao de outros Agaricales. Modificações e aspecto das hifas, e a formação de uma camada superficial a partir de fusão de hifas, foram correlacionadas à emergência de primórdios. As fases de nódulo hifal, agregado, primórdio inicial e primórdio diferenciado foram detectadas.
A análise morfológica permitiu, também, inferir aspectos morfogenéticos. Para a análise dos genes envolvidos foi feita uma biblioteca de cDNA representativa de toda a fase de frutificação do fungo. Os 2759 ESTs (Expressed Sequence Tags) foram analisados in silico para a busca de genes candidatos. A expressão gênica foi avaliada para alguns ESTs selecionados. Um macroarranjo foi feito com 192 clones e hibridizado com cDNAs obtidos do micélio em momentos anteriores à formação dos basidiomatas. Adicionalmente, doze genes candidatos foram analisados por RT-qPCR. A análise in silico da biblioteca possibilitou a identificação de 1533 unigenes dos 2759 cromatogramas produzidos. Destes, 981 apresentaram similaridade a genes com funções conhecidas e 1374 foram presentes também no genoma de M. perniciosa, indicando que algumas das seqüências sem similaridade nos bancos de dados analisados podem ser genes ainda não descritos em outras espécies. Foram identificados prováveis genes que codificam para hemolisinas, hidrofobinas, citocromo p450 monoxigenase, ciclofilinas, o-merilstigmato oxigenase, dentre outros, comuns em basidiomicetos durante o desenvolvimento de basidiomatas. A análise da abundância de transcritos mostrou 25 genes que tiveram um pico de expressão no micélio com primórdios e 43 mais abundantes nesta mesma fase e também em basidiomatas maduros. Os doze genes analisados por RT-qPCR mostraram perfis mais detalhados de expressão e indicaram a ativação da produção inicial de basidiomatas ainda na fase de micélio rosa avermelhado, coincidindo com os dados morfológicos. As seqüências da biblioteca foram também utilizadas para a identificação de genes no genoma. Cerca de 14.000 genes foram preditos nesse fungo, sendo que os ESTs gerados neste trabalho contribuíram para essa identificação e também para a determinação do padrão de introns do fungo. A identificação de genes presentes nessa fase do ciclo de vida do M. perniciosa abre
caminho para estudos genéticos de processos biológicos que levam à frutificação em basidiomicetos. Este é o primeiro estudo morfológico comparando o desenvolvimento inicial de basidiomatas in vivo e in vitro de M. perniciosa e a primeira descrição de genes expressos nessa fase do ciclo de vida fungo.
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Abstract: Moniliophthora pemiciosa is a hemibiotrophic basidiomycete that infects cocoa and other plant species. The symptoms in the infected plants range from secondary growth, epinasty, hyperplasia and finally necrosis of tissues. The dead tissues are the raw material to produce spores within structures called basidiomatas. The purpose of this study was to understand how the fungus is preparing itself to produce the reproductive structures (basidiomatas) and which genes are related to that process. Morphological analysis of mycelium prior to emergence of basidiomatas was conduced by stereomicroscopy, light microscopy and scanning electron microscopy. To analyze the genes involved in basidiomata development, RNA from previous and fructification phases in artificial medium were used to create a representative cDNA library of the fungus. The 2759 ESTs (expressed sequence tags) obtained were analyzed in silico searching for candidate genes. The gene expression was evaluated for some selected ESTs. A macroarray analysis was performed with 192 selected clones and hybridized with RNAs extracted from mycelium in different phases during basidiomata formation. In addition, twelve candidate genes were analyzed by RT-qPCR. The morphological changes observed for the mycelium prior fructification show a pattern similar to other members of the order Agaricales. Changes and appearance of hyphae forming a surface layer from the fusion of hyphae were correlated with the emergence of primordia. The stages of nodule hifal, aggregate, initial primordium and differentiated primordium were detected. Morphological analysis has also inferred morphogenetic aspects. The in silico analysis of the library enabled the identification of 1,533 unigenes of 2,759 chromatograms produced. Of these 981 showed similarities to genes with known functions, and 1,374 were also present in the genome of M. perniciosa, indicating that some of the sequences without similarity in the databases can be analyzed genes not yet described. We identified candidate. genes that encode for hemolysin, hydrophobins, P450 monoxygenase, cyclophilin the merilstigmato-oxygenase, among others, also common in fungi during fruiting. The analysis of the abundance of transcripts showed that 25 genes had a peak of expression in mycelium with primordia with 43 and more abundant in this phase and also in mature basidiomatas. The twelve genes analyzed by RT-qPCR showed more detailed profiles of expression and indicated the activation of the initial production of basidiomatas still in reddish pink mycelium, correlates with the morphological data. The sequences of the library were also used to identify genes in the genome. Approximately 14,000 genes were predicted in this fungus, and the ESTs generated here contributed to this identification and also for determining the pattern of the fungus introns. The identification of genes present in this phase of the life cycle of M. perniciosa opens for new possibilities to control the spread of the fungus and also for genetic studies of biological processes that lead to fruiting in basidiomycetes. This is the first morphologic study of comparing both in vivo and in vitro early development of basidiomatas of M. perniciosa and the first description of genes expressed at that stage of the life cycle of this fungus. Ver menos