Caracterização estrutural e funcional das glutarredoxinas ditiolicas de Saccharomyces cerevisiae
karen Fulan Discola
TESE
Português
T/UNICAMP D631c
Campinas, SP : [s.n.], 2009.
190 p. : il.
Orientador: Luis Eduardo Soares Netto
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Glutarredoxinas (Grxs) são pequenas oxidorredutases que possuem pelo menos um resíduo de cisteína conservado em seus sítios ativos e têm atividade dissulfeto redutase dependente de tiol. Embora Grxs estejam envolvidas em diversos processos celulares, como enovelamento protéico e proteção...
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Resumo: Glutarredoxinas (Grxs) são pequenas oxidorredutases que possuem pelo menos um resíduo de cisteína conservado em seus sítios ativos e têm atividade dissulfeto redutase dependente de tiol. Embora Grxs estejam envolvidas em diversos processos celulares, como enovelamento protéico e proteção contra espécies reativas de oxigênio, poucos substratos biológicos dessas enzimas são conhecidos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, oito Grxs foram identificadas (ScGrx1-8); destas ScGrx1-2 são ditiólicas e possuem o motivo Cys-Pro-Tyr-Cys em seus sítios ativos. Ambas Grxs ditiólicas são citosólicas, embora ScGrx2 também seja encontrada na mitocôndria. Neste trabalho, mostramos que ScGrx2 possui atividade específica como oxidorredutase quinze vezes maior do que ScGrx1, embora estas enzimas compartilhem 64% de identidade e 85% de similaridade de seqüência. A análise cinética bi-substrato mostrou que ScGrx2 possui tanto um menor KM para glutationa quanto um maior turnover que ScGrx1. Com o intuito de compreender melhor estas diferenças bioquímicas, determinamos os valores de pKa da cisteína N-terminal (Cys27) dos sítios ativos destas duas proteínas e demonstramos que estes parâmetros não justificam a diferença de atividade observada. Tentando identificar características estruturais relacionadas a essa diferença de atividade, determinamos as estruturas cristalográficas de ScGrx2 na forma oxidada e do mutante ScGrx2-C30S ligado à
glutationa a 2.05 e 1.91 Å de resolução, respectivamente, e comparamos estas estruturas com as estruturas de ScGrx1 descritas por Håkansson & Winther, 2007. As análises estruturais nos permitiram formular a hipótese de que substituições dos resíduos Ser23 e Gln52 de ScGrx1 por Ala23 e Glu52 em ScGrx2 poderiam modificar a capacidade da cisteína C-terminal do sítio ativo de atacar o dissulfeto misto formado entre a cisteína Nterminal e glutationa. Nossa hipótese foi testada através de ensaios enzimáticos com proteínas mutantes. Acreditamos que as diferenças funcionais e estruturais observadas entre ScGrx1 e ScGrx2 possam refletir em variações na especificidade por substratos e indicam que estas enzimas possuem funções biológicas não redundantes em S. cerevisiae.
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glutationa a 2.05 e 1.91 Å de resolução, respectivamente, e comparamos estas estruturas com as estruturas de ScGrx1 descritas por Håkansson & Winther, 2007. As análises estruturais nos permitiram formular a hipótese de que substituições dos resíduos Ser23 e Gln52 de ScGrx1 por Ala23 e Glu52 em ScGrx2 poderiam modificar a capacidade da cisteína C-terminal do sítio ativo de atacar o dissulfeto misto formado entre a cisteína Nterminal e glutationa. Nossa hipótese foi testada através de ensaios enzimáticos com proteínas mutantes. Acreditamos que as diferenças funcionais e estruturais observadas entre ScGrx1 e ScGrx2 possam refletir em variações na especificidade por substratos e indicam que estas enzimas possuem funções biológicas não redundantes em S. cerevisiae.
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Abstract: Glutaredoxins (Grxs) are small thiol-dependent oxidoreductases with disulfide reductase activity endowed by at least one cysteine at their active sites. Although Grxs are implicated in many cellular processes, including protein folding and protection against reactive oxygen species, few of...
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Abstract: Glutaredoxins (Grxs) are small thiol-dependent oxidoreductases with disulfide reductase activity endowed by at least one cysteine at their active sites. Although Grxs are implicated in many cellular processes, including protein folding and protection against reactive oxygen species, few of their targets are known. In the yeast Saccharomyces
cerevisiae, eight Grxs isoforms were identified (ScGrx1-8). Two of them (ScGrx1-2) are dithiolic, possessing a conserved Cys-Pro-Tyr-Cys motif. Both dithiol glutaredoxins are cytosolic, however ScGrx2 is also located at the mitochondria. In spite of the fact that ScGrx1 and ScGrx2 share 85% of amino acid sequence similarity, we have shown that ScGrx2 is fifteen times more active as oxidoreductase than ScGrx1. Further characterization of the enzymatic activities through two-substrate kinetics analysis revealed that ScGrx2 possesses both a lower KM for glutathione and a higher turnover than ScGrx1. To better comprehend these biochemical differences, the pKa of the N-terminal active site cysteines (Cys27) of these two proteins were determined. Since the pKa values of ScGrx1 and ScGrx2 Cys27 residues are very similar, these parameters cannot account for the difference observed between their specific activities. In an attempt to better understand the mechanisms and differences between yeast dithiol Grxs activities, we elucidated the crystallographic structures of ScGrx2 in the oxidized state and of the ScGrx2-C30S mutant with a glutathionyl mixed disulfide at resolutions of 2.05 and 1.91 Å, respectively. Comparisons among these structures and those of ScGrx1 (Håkansson & Winther, 2007) provided insights into the remarkable functional divergence between these enzymes. We hypothesize that the substitutions of Ser23 and Gln52 in ScGrx1 by Ala23 and Glu52 in ScGrx2 can modify the capability of the active site C-terminal cysteine to attack the mixed disulfide between the N-terminal active site cysteine and the glutathione molecule. Mutagenesis studies supported this hypothesis. The observed structural and functional differences between ScGrx1 and ScGrx2 may reflect variations in substrate specificity and non-redundant biological functions.
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cerevisiae, eight Grxs isoforms were identified (ScGrx1-8). Two of them (ScGrx1-2) are dithiolic, possessing a conserved Cys-Pro-Tyr-Cys motif. Both dithiol glutaredoxins are cytosolic, however ScGrx2 is also located at the mitochondria. In spite of the fact that ScGrx1 and ScGrx2 share 85% of amino acid sequence similarity, we have shown that ScGrx2 is fifteen times more active as oxidoreductase than ScGrx1. Further characterization of the enzymatic activities through two-substrate kinetics analysis revealed that ScGrx2 possesses both a lower KM for glutathione and a higher turnover than ScGrx1. To better comprehend these biochemical differences, the pKa of the N-terminal active site cysteines (Cys27) of these two proteins were determined. Since the pKa values of ScGrx1 and ScGrx2 Cys27 residues are very similar, these parameters cannot account for the difference observed between their specific activities. In an attempt to better understand the mechanisms and differences between yeast dithiol Grxs activities, we elucidated the crystallographic structures of ScGrx2 in the oxidized state and of the ScGrx2-C30S mutant with a glutathionyl mixed disulfide at resolutions of 2.05 and 1.91 Å, respectively. Comparisons among these structures and those of ScGrx1 (Håkansson & Winther, 2007) provided insights into the remarkable functional divergence between these enzymes. We hypothesize that the substitutions of Ser23 and Gln52 in ScGrx1 by Ala23 and Glu52 in ScGrx2 can modify the capability of the active site C-terminal cysteine to attack the mixed disulfide between the N-terminal active site cysteine and the glutathione molecule. Mutagenesis studies supported this hypothesis. The observed structural and functional differences between ScGrx1 and ScGrx2 may reflect variations in substrate specificity and non-redundant biological functions.
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Soares Netto, Luis Eduardo, 1964-
Orientador
Netto, Luis Eduardo Soares, 1964-
Orientador
Kobarg, Jörg, 1965-
Avaliador
Garratt, Richard Charles
Avaliador
Laurindo, Francisco Rafael Martins
Avaliador
Nonato, Maria Cristina
Avaliador
Caracterização estrutural e funcional das glutarredoxinas ditiolicas de Saccharomyces cerevisiae
karen Fulan Discola
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