Orientador : Yoko B. Rosato

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Xanthomonas campestris é uma bactéria fitopatogênica responsável pela podridão negra de várias espécies vegetais e produtora de um mucopolissacarídeo extracelular de ampla utilização industrial conhecido como goma xantana. Com o intuito de se obter linhagens desta bactéria com alta...

Resumo: Xanthomonas campestris é uma bactéria fitopatogênica responsável pela podridão negra de várias espécies vegetais e produtora de um mucopolissacarídeo extracelular de ampla utilização industrial conhecido como goma xantana. Com o intuito de se obter linhagens desta bactéria com alta capacidade de expressão do gene da alfa-amilase e potencialmente capazes de produzir a goma, xantana a partir de substratos amiláceos, foram clonadas e caracterizadas seqüências promotoras específicas de x.campestris e, de posse destas foram construídos e introduzidos em duas de suas linhagens (REF Cmr e 280 Nalr) quatro vetores distintos portadores do gene da alfa-amilase de Bacillus subtilis; (1) pAP2X, contendo o gene amy sob o controle do promotor de B. subtilis; (2) pAP2X, contendo o gene amy sob controle do promotor de X. campestris em adição ao promotor original; (3) pAP23, construção semelhante à do pAP2 contendo a inserção do locus de estabilização parB; e (4) pAP23X, obtido a partir da introdução do promotor de Xanthomonas no pAP23. Análises do nível de estabilização obtido após a introdução do locus parB no plasmidio pAP2 mostraram que linhagens portadoras do plasmidio contendo este locus estabilizador apresentaram índice de perda plasmidial até 27 vezes menor do que aquelas cujo plasmidio não fora dotado desse locus. A quantificação da produção de alfa-amilase pelas oito linhagens obtidas após a introdução dos plasmidios em X.campestris mostrou que linhagens originalmente amilolíticas (Cm r), portadoras de vetores nos quais o gene sob o controle do promotor específico dessa bactéria, apresentaram atividade específica de alfa-amilase 100% superior a da linhagem controle, chegando esta diferença à 300% no caso das linhagens originalmente não amilolíticas (Na I r). Apesar de nenhuma das linhagens obtidas ter se mostrado capaz de produzir goma xantana tendo o amido como único substrato, o caráter amilolítico introduzido conferiu a estas bactérias, de um modo geral, melhor capacidade de aproveitamento de todos os substratos estudados (sacarose, amido e amido+sacarose) para produção de xantana, tendo o mais alto nível de produção correspondido ao da linhagem N2X (portadora do plasmidio amilolítico onde foi introduzido o promotor de X. campestris) crescida em amido+sacarose. Estes resultados permitem considerar promissoras as possibilidades de produção de goma xantana a partir de amido, sendo para tanto necessários alguns estudos adicionais envolvendo a caracterização dos produtos de hidrólise do amido por esta alfa amilase de B. subtilis e seu aproveitamento por linhagens de X. campestris

Abstract: Xanthomonas campestris is a phytopathogenic bacteria responsible for the black rot of crucifers and a variety of other economically important plant diseases, and which produces an exopolisacharide with large industrial applications known as xanthan gum. Promoter sequences isolated from X....

Abstract: Xanthomonas campestris is a phytopathogenic bacteria responsible for the black rot of crucifers and a variety of other economically important plant diseases, and which produces an exopolisacharide with large industrial applications known as xanthan gum. Promoter sequences isolated from X. campestris were cloned and four plasmids harboring the amy gene of B. subtilis were constructed in order to obtain strains showing high expression of the alpha-amylase gene and thus potentially capable to use starch in fermentation processes, The new plasmids constructed were: (i) pAP2, which contains the amy gene under the control of its original promoter of Bacillus; (ii) pAP2X, which contains an aditional promoter of X. campestris placed upstream of the amy gene; (iii) pAP23, obtained upon introduction of the stabilizer locus parB in pAP2; and (iv) pAP23X, obtained upon introduction of the Xanthomonas promoter sequence in pAP23. Analysis of the stabilization levels obtained after the introduction of parB in pAP2 showed a reduction of up to 27 times in the loss rate of plasmid containing this locus. Quantification of the alpha-amylase production by the 8 strains obtained after the introduction of the new plasmids in X campestris showed that, strains containing both Bacillus and Xanthomonas promoters were able to produce up to 300% more alpha-amylase than strains lacking those plasmids. Although none of the strains tested has been able to produce xanthan gum from starch, the amylolitic character introduced improved their capacity to utilize starch containing media (starch and starch plus sucrose) for the production of this biopolymer. The highest level of xantan production was achieved by strain N2X, wich harbours the amylolitic plasmid with the insertion of the X. campestris promoter (pAP2X). These show that there are promising possibilities for the production of xanthan gum utilizing starch as the unique carbon source, although aditional studies involving characterization of the hydrolysis products of the alpha-amylase gene cloned from B. subtilis and their utilization by strains of X. campestris should still be carried aut