Orientador: Paulo Arruda

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Estudos recentes tem demonstrado a grande importância da via metabólica do ácido aspártico em plantas. Por esta via metabólica se produz os aminoácidos Essenciais: lisina, treonina e metionina. Estes aminoácidos encontram-se em baixos teores em todos os cereais caracterizando esse grupo...

Resumo: Estudos recentes tem demonstrado a grande importância da via metabólica do ácido aspártico em plantas. Por esta via metabólica se produz os aminoácidos Essenciais: lisina, treonina e metionina. Estes aminoácidos encontram-se em baixos teores em todos os cereais caracterizando esse grupo vegetal como de baixa qualidade nutritiva. Os conhecimentos adquiridos a respeito do sistema de regulação da via de biossíntese desses aminoácidos levou alguns pesquisadores a elaborarem uma estratégia para a seleção de mutantes, através de cultura de tecidos, que apresentam pontos de regulação relaxados. Com isso a via metabólica como um todo fluiria de forma a levar ao acúmulo dos aminoácidos que atuam como produtos finais. Para a seleção desses mutantes, são utilizadas combinações de aminoácidos produtos finas ou análogos de aminoácidos que quando adicionados ao meio inibem drasticamente o crescimento da cultura. Células que eventualmente apresentam crescimento normal tem grande chance de serem mutantes reguIatórios. Resultados positivos tem sido obtidos em várias espécies de plantas. Nesse trabalho utilizamos a metodologia para a seleção de cultura de tecido de milho de mutantes resistentes ao análogo de lisina livre aminoetilcisteína, que apresentassem acúmulo de lisina livre na semente. Obtivemos calos embriogênicos friáveis com resistência a aminoeticisteína variando de 0,25mM até 0,5mM. Destes calos obtivemos várias plantas dentre as quais duas apresentaram dois sistemas genéticos diferentes para a resistência. Um com dominância para a resistência e outro com característica recessiva para a resistência. Em ambos os casos um aumento no teor de lisina livre foi observado. Além disso, um mutante de milho dominante para a resistência a lisina mais treonina, obtido também por cultura de tecidos por Hibberd e Green (1982), teve suas características genéticas, bioquímicas e agronômicas parcialmente estudadas. Determinou-se que o gene Ltr*19, responsável pela resistência à lisina mais treonina, está localizado no braço curto do cromossomo 7 a 10.57+ -1.38 centimorgans do gene opaque-2. Este gene foi combinado com os genes mutantes de endospermas opaque-2, brittle-1 e shrunken-2 e suas interações observadas através da análise do teor e composição dos aminoácidos livres em sementes. Verificou-se que o gene Ltr*19 é responsável diretamente por um acúmulo de 8 vezes no teor de treonina e de 4,5 vezes no teor de serina. Determinou-se também que o duplo mutante Ltr*19 e opaque-2 apresenta um aumento extremamente acentuado nos teores de treonina e serina além de um aumento no teor total de aminoácidos livres. Este aumento não se deve somente ao aumento de treonina e serina, mas também a um aumento dos outros aminoácidos. A quantificação das frases protéicas deste duplo mutante parece indicar que o gene Ltr*19 intensifica o efeito do gene opaque-2, diminuindo o teor de zeína e aumentando os teores de albuminas, globulinas aminoácidos livres e glutelinas. Entretanto, essas modificações não são alterações de bandas protéicas pois a comparação eletroforética das frações protéicas entre o duplo mutante Ltr*19, opaque-2 e as sementes normais não mostrou nenhuma diferença

Abstract: The essential amino acids lysine, threonine and methionine are derived from the aspartate family of amino acids in pIants. Since the cereaIs are devoid in at least one of these amino acids, the aspartate pathway has received great attention in the last recent years. Biochemical, moIecular...

Abstract: The essential amino acids lysine, threonine and methionine are derived from the aspartate family of amino acids in pIants. Since the cereaIs are devoid in at least one of these amino acids, the aspartate pathway has received great attention in the last recent years. Biochemical, moIecular and genetic studies has lead to a deep understand of the regulation of the aspartate family showing that many branch poiny enzymes are positively or negatively regulated by feedback. Many investigators have proved the regulation of the key points by finding mutants with aItered regulation of aspartate pathway. Several studies showed that the regulatory mutants has leveIs of some of the amino acids and products. With the advance of the tissue culture and technics and plants regeneration selection of biochemical mutants became as an important system to study mutants can be with altered regulation of amino acid biosynthesis. Such mutants can be easily selected in a petridish containing millions of cells pIated on selective medium added of combinations of the amino acids and products or amino acids analogs. In this study maize tissue culture was used select plants resistant to the lysine analog aminoethylcysteine. In addition, mutant resistant to lysine plus threonine which selected by Hibberd and Green, (1982), was included in the studies. Combinations of the lysines plus trheonine resistant mutant, with the maize endosperrn mutants opaque-2, brittle-1 and shrunken-2 were performed to study the effect of such combination on the biosynthesis of amino acid and proteins in the seeds. Resistance embriogenic cali of a maize inbred line were selected in medium containing from 0,25 to 0,5mM of aminoethylcysteine. These cali were used for plant regeneration. From 63 regenerated plants two presented R1 progenies which when selfed polinated segregates resistant and sensitive plants. The resistance of one R0 plants showed to be determined by a singIe dominant gene while the other showed to be determined by a single recessive gene. Both resistant mutant presented increased free lysine leveI when compared with sensitive plants.The resistance of the lysine plus threonine mutant is determined by a single dominant gene, named Ltr*i9. 1his gene was transferred to two maize inbred lines containig normal, opaque-2, brittle-1 and shrunken-2 endosperms by successive backcrosses. The genetic analysis of single an double mutants revealed that the Ltr*19 gene is located in the short arm of cromossome 7, at 10.57+ - 1,38 centimorgans of the opaque-2 gene. The presence of the Ltr*19 gene increase 8 times the free threonine leveI in the normal endosperm. A synergistic effect on the increase of free threonine was observed when the Ltr*19 gene was combined in a double mutant with the opaque-2 gene. It was observed also that the Ltr*19 gene intensify the effect of opaque-2 gene on amino acid and protein synthesis in the endosperm. SDS-PAGE and IEF analysis of single and double mutants containing the Ltr*19 and end endosperm mutant did not show any difference in the polypeptide profile which could be attributed to the Ltr*19 gene