Orientador : Hiroshi Aoyama

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A treónil-Trna sintetase foi purificada de fígado bovino utilizando-se centrifugações diferenciais, saturação fracionada com sulfato de amônio e cromatografias em DEAE-celulose, hidroxiapatita e fosfocelulose. A purificação foi de cerca de 120 vezes, com renimento de 7%. A eletroforese em...

Resumo: A treónil-Trna sintetase foi purificada de fígado bovino utilizando-se centrifugações diferenciais, saturação fracionada com sulfato de amônio e cromatografias em DEAE-celulose, hidroxiapatita e fosfocelulose. A purificação foi de cerca de 120 vezes, com renimento de 7%. A eletroforese em gel de poliacrilamida mostrou que a purificação não está totalmente homogênea. A enzima é mais estável a -20ºC em presença de 50% glicerol. Com esta enzima foram realizados estudos físicoquímicos com a finalidade de determinar alguns parâmetros cinéticos. Na reação de intercâmbio ATP-Ppi, onde a presença de tRNA não é necessária, e as especificidades pela treonina e pelo ATP são bastante altas, obteve-se KM(ATP)=1,1.10-4M; KM(treonina) = 1,2.10-4M; KM(pirofosfato) = 2,1.10-4M. Na reação de formação de treonil-tRNA foram obtidos KM(ATP) = 2,2.10-5M; KM(treonina)=4.10-6M; KM(tRNA) = 2,4.10-4M. Ambas as reações dependem de Mg2+ e são sensíveis a reagentes sulfidrílicos

Abstract: Threonyl-tRNA synthetase was extracted from beef liver and purified by differential centrifugations, neutral salt precipitation and chromatographic procedures. The degree of purification obtained about 120 fold, with a yield of 7%. The analysis by polyacrylamide electrophoresis has shown a...

Abstract: Threonyl-tRNA synthetase was extracted from beef liver and purified by differential centrifugations, neutral salt precipitation and chromatographic procedures. The degree of purification obtained about 120 fold, with a yield of 7%. The analysis by polyacrylamide electrophoresis has shown a small heterogeneity at the last step of the enzyme purification. The kinetic parameters were studied and the KM values determined: KM(ATP) = 1,1x10-4M; KM(threonine) = 1,2x10-4M and KM(PPi) =2.1x10-4M for ATP-Ppi exchange reaction. For threonyl-tRNA formation reaction the KM values found were? 2.2 a 10-5M (ATP)/ 4x10-6M (threonine) and 2.4x10-4M (tRNA). Both reactions were Mg2+ dependent and presented sensibility to sulfhydryl reagents