Identificação e caracterização funcional dos elementos cis-regulatorios da miostatina
Carla Vermeulen Carvalho Grade
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP G754i
[Identification and functional characterization of the cis-regulatory elements of myostatin]
Campinas, SP : [s.n.], 2009.
90f. : il.
Orientador: Lucia Elvira Alvares
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: A proteina Miostatina (tambem conhecida como GDF8) e um membro da
superfamilia de crescimento e diferenciacao ß (TGF- ß) e e expressa quase que
exclusivamente em musculatura esqueletica, tanto no embriao em desenvolvimento
quanto no individuo adulto, onde circula livre pela corrente... Ver mais Resumo: A proteina Miostatina (tambem conhecida como GDF8) e um membro da
superfamilia de crescimento e diferenciacao ß (TGF- ß) e e expressa quase que
exclusivamente em musculatura esqueletica, tanto no embriao em desenvolvimento
quanto no individuo adulto, onde circula livre pela corrente sanguinea. A Miostatina foi
inicialmente identificada em 1997 por MCPHERRON et al. e, desde entao, muitos estudos
tem demonstrado seu papel essencial na regulacao do desenvolvimento de musculatura
esqueletica de aves e mamiferos. O nocaute genico da Miostatina causa hiperplasia e
hipertrofia das fibras musculares, resultando em musculos individuais ate duas vezes
maiores do que em animais selvagens. Isso demonstra que a Miostatina e um regulador
negativo da deposicao de musculatura esqueletica. A estrutura e a funcao desta proteina
sao conservadas em diversas especies, incluindo humanos, onde os niveis de Miostatina
circulante no sangue se encontram aumentados durante condicoes de distrofia e na
caquexia que acompanha alguns tipos de cancer e a AIDS. Um melhor entendimento dos
mecanismos que regem a expressao da Miostatina e essencial para o desenvolvimento
de estrategias que possam regular sua atividade durante tais condicoes. No presente
trabalho, nos identificamos, com o uso de ferramentas de Bioinformatica, elementos cisregulatorios
putativos (promotor e enhancers) que possivelmente regulam a transcricao do
gene da Miostatina. Inicialmente foi realizada uma comparacao dos loci do GDF8,
incluindo as regioes intergenicas adjacentes, provenientes dos genomas de Humano,
Camundongo e Galinha. Essa analise revelou a presenca de diferentes regioes
evolutivamente conservadas (RECs) adjacentes a sequencia codificadora desta proteina,
sete downstream e uma upstream ao gene. Por terem sido mantidas relativamente
conservadas ao longo da evolucao, essas regioes supostamente possuem um papel
funcional, possivelmente como elementos cis-regulatorios do gene da Miostatina. Em seguida, com o intuito de entender as funcoes que cada uma dessas regioes possa estar
exercendo sobre a regulacao da atividade transcricional do gene da Miostatina, foi
realizada uma busca por sitios de ligacao para fatores transcricionais que tenham sido
conservados evolutivamente nessas RECs. Muitos sitios conservados foram observados
nas sete RECs downstream ao gene da Miostatina, entre eles estao sitios para fatores
relacionados ao desenvolvimento de musculatura esqueletica (MyoD, Myogenin, E47,
EN1), membros (Pax3, Tbx5) e coracao (Nkx2.5, Pitx2). Juntos, esses dados sugerem
uma regulacao modular do gene da Miostatina durante a embriogenese dos vertebrados.
A unica REC localizada upstream ao GDF8 representa o promotor minimo putativo deste
gene. Essa hipotese e reforcada pela presenca de um sitio de ligacao conservado para a
Proteina de Ligacao ao sitio TATA. Com o intuito de validar as hipoteses formuladas com
base nas analises de Bioinformatica, no presente trabalho buscamos caracterizar
funcionalmente o promotor minimo do gene da Miostatina. Para tanto, a regiao do
promotor minimo foi inicialmente clonada em um vetor que nao contem promotor e possui
como gene reporter o GFP. Essa construcao de expressao foi entao testada atraves de
experimentos de eletroporacao em embrioes de galinha in ovo. A analise dos embrioes
eletroporados revelou que a regiao de DNA elegida para as analises funcionais e capaz
de dirigir a transcricao do gene reporter, indicando que ela corresponde ao promotor
minimo do gene da Miostatina. Alem do sitio TATA, ha, na regiao do promotor, diversos
sitios conservados para a ligacao de proteinas envolvidas na via de sinalizacao mediada
por cAMP (CREB, ATF, NFY). Esse achado esta de acordo com estudos recentes que
demonstram o envolvimento do cAMP na regulacao dos fatores miogenicos Myf5 e MyoD,
bem como de Pax3, sugerindo que a atividade do gene da Miostatina tambem possa estar
sendo regulada por essa via de sinalizacao. Outras regioes do genoma humano que
possuem arquitetura semelhante a observada no promotor da Miostatina foram
identificadas, demonstrando que outros genes podem estar sob influencia da mesma via de sinalizacao que regula a atividade do promotor da Miostatina, dentre eles genes
envolvidos na miogenese e neurogenese.
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superfamilia de crescimento e diferenciacao ß (TGF- ß) e e expressa quase que
exclusivamente em musculatura esqueletica, tanto no embriao em desenvolvimento
quanto no individuo adulto, onde circula livre pela corrente... Ver mais Resumo: A proteina Miostatina (tambem conhecida como GDF8) e um membro da
superfamilia de crescimento e diferenciacao ß (TGF- ß) e e expressa quase que
exclusivamente em musculatura esqueletica, tanto no embriao em desenvolvimento
quanto no individuo adulto, onde circula livre pela corrente sanguinea. A Miostatina foi
inicialmente identificada em 1997 por MCPHERRON et al. e, desde entao, muitos estudos
tem demonstrado seu papel essencial na regulacao do desenvolvimento de musculatura
esqueletica de aves e mamiferos. O nocaute genico da Miostatina causa hiperplasia e
hipertrofia das fibras musculares, resultando em musculos individuais ate duas vezes
maiores do que em animais selvagens. Isso demonstra que a Miostatina e um regulador
negativo da deposicao de musculatura esqueletica. A estrutura e a funcao desta proteina
sao conservadas em diversas especies, incluindo humanos, onde os niveis de Miostatina
circulante no sangue se encontram aumentados durante condicoes de distrofia e na
caquexia que acompanha alguns tipos de cancer e a AIDS. Um melhor entendimento dos
mecanismos que regem a expressao da Miostatina e essencial para o desenvolvimento
de estrategias que possam regular sua atividade durante tais condicoes. No presente
trabalho, nos identificamos, com o uso de ferramentas de Bioinformatica, elementos cisregulatorios
putativos (promotor e enhancers) que possivelmente regulam a transcricao do
gene da Miostatina. Inicialmente foi realizada uma comparacao dos loci do GDF8,
incluindo as regioes intergenicas adjacentes, provenientes dos genomas de Humano,
Camundongo e Galinha. Essa analise revelou a presenca de diferentes regioes
evolutivamente conservadas (RECs) adjacentes a sequencia codificadora desta proteina,
sete downstream e uma upstream ao gene. Por terem sido mantidas relativamente
conservadas ao longo da evolucao, essas regioes supostamente possuem um papel
funcional, possivelmente como elementos cis-regulatorios do gene da Miostatina. Em seguida, com o intuito de entender as funcoes que cada uma dessas regioes possa estar
exercendo sobre a regulacao da atividade transcricional do gene da Miostatina, foi
realizada uma busca por sitios de ligacao para fatores transcricionais que tenham sido
conservados evolutivamente nessas RECs. Muitos sitios conservados foram observados
nas sete RECs downstream ao gene da Miostatina, entre eles estao sitios para fatores
relacionados ao desenvolvimento de musculatura esqueletica (MyoD, Myogenin, E47,
EN1), membros (Pax3, Tbx5) e coracao (Nkx2.5, Pitx2). Juntos, esses dados sugerem
uma regulacao modular do gene da Miostatina durante a embriogenese dos vertebrados.
A unica REC localizada upstream ao GDF8 representa o promotor minimo putativo deste
gene. Essa hipotese e reforcada pela presenca de um sitio de ligacao conservado para a
Proteina de Ligacao ao sitio TATA. Com o intuito de validar as hipoteses formuladas com
base nas analises de Bioinformatica, no presente trabalho buscamos caracterizar
funcionalmente o promotor minimo do gene da Miostatina. Para tanto, a regiao do
promotor minimo foi inicialmente clonada em um vetor que nao contem promotor e possui
como gene reporter o GFP. Essa construcao de expressao foi entao testada atraves de
experimentos de eletroporacao em embrioes de galinha in ovo. A analise dos embrioes
eletroporados revelou que a regiao de DNA elegida para as analises funcionais e capaz
de dirigir a transcricao do gene reporter, indicando que ela corresponde ao promotor
minimo do gene da Miostatina. Alem do sitio TATA, ha, na regiao do promotor, diversos
sitios conservados para a ligacao de proteinas envolvidas na via de sinalizacao mediada
por cAMP (CREB, ATF, NFY). Esse achado esta de acordo com estudos recentes que
demonstram o envolvimento do cAMP na regulacao dos fatores miogenicos Myf5 e MyoD,
bem como de Pax3, sugerindo que a atividade do gene da Miostatina tambem possa estar
sendo regulada por essa via de sinalizacao. Outras regioes do genoma humano que
possuem arquitetura semelhante a observada no promotor da Miostatina foram
identificadas, demonstrando que outros genes podem estar sob influencia da mesma via de sinalizacao que regula a atividade do promotor da Miostatina, dentre eles genes
envolvidos na miogenese e neurogenese.
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Abstract: The Myostatin protein (also known as GDF8) is a member of the transforming
growth factor-ß (TGF-ß) superfamily and is expressed almost exclusively in skeletal
muscle, both in the embryo and in the adult, where the protein circulates in the blood flow.
It was initially identified in 1997 by... Ver mais Abstract: The Myostatin protein (also known as GDF8) is a member of the transforming
growth factor-ß (TGF-ß) superfamily and is expressed almost exclusively in skeletal
muscle, both in the embryo and in the adult, where the protein circulates in the blood flow.
It was initially identified in 1997 by MCPHERRON et al., and since then many studies have
been demonstrating its essential role in the regulation of the development of skeletal
muscle from birds and mammals. The knockout of the Myostatin gene causes both
hyperplasia and hypertrophy of the skeletal muscle fibers, resulting in muscles twice as big
as the wildtype ones, thus showing that Myostatin is a negative regulator of skeletal
muscle deposition. The GDF8 structure and function is conserved in many species,
including humans where the Myostatin levels are increased during dystrophy conditions
and in the cachexia that accompanies some types of cancer and AIDS. A better
understanding of the mechanisms that rule the Myostatin expression is essential for the
development of strategies that might regulate its activity during such conditions. In this
research, we have identified, with the use of bioinformatic tools, the cis-regulatory
elements (promoter and enhancers) that regulate the Myostatin gene transcription. We
compared the GDF8 loci from human, chicken and mouse and found different evolutionary
conserved regions (ECRs), adjacent to the GDF8 coding sequence. Because these
intergenic sequences remained relatively conserved throughout evolution, they supposedly
have a functional role, possibly as cis-regulatory elements for the Myostatin gene. Our
analyses revealed the presence of seven possible enhancers downstream of the GDF8
gene and one conserved region upstream of it. In order to understand the role these
regions might have in the regulation of Myostatin's transcription activity, we searched for
binding sites that were also evolutionary conserved. Many conserved binding sites were
observed in the RECs downstream to the Myostatin gene, and among them are sites for
factors related to the development of the skeletal muscle (MyoD, Myogenin, E47, EN1),
limbs (Pax3, Tbx5) and heart (Nkx2.5, AREB6, Pitx2). Together, these data suggest a
modular regulation of the Myostatin gene during vertebrates' embryogenesis. The only
REC observed upstream of the Myostatin locus represents the putative basal gene
promoter. This hypothesis is strengthened by the presence of a binding site for the Tata
Binding Protein conserved for the studied species. In this research, we aimed at
functionally characterizing the Myostatin gene basal promoter. For that purpose, we
cloned the studied region in a promoterless vector, which contains GFP as a reporter
gene. This expression construct was then tested through in ovo electroporation assays.
The analysis of the electroporated embryos revealed that the cloned DNA region is
capable of driving the transcription of the reporter gene, which indicates that it truly
corresponds to the basal promoter of the Myostatin gene. Moreover, there are conserved
binding sites for the CREB and ATF1 transcription factors in the basal promoter, which are
activated by the cAMP signaling path. This finding is in agreement with recent studies that
demonstrate the involvement of cAMP in the regulation of the myogenic factors Myf5 and
MyoD, as well as Pax3, thus suggesting that the activity of the Myostatin gene might be
under the influence of this signaling path. Other regions of the human genome that have
a similar architecture to the one observed in the Myostatin promoter were identified. This
demonstrates that other genes are possibly under the influence of the same signaling path
regulating the activity of the Myostatin promoter, among them genes involved in
myogenesis and neurogenesis.
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growth factor-ß (TGF-ß) superfamily and is expressed almost exclusively in skeletal
muscle, both in the embryo and in the adult, where the protein circulates in the blood flow.
It was initially identified in 1997 by... Ver mais Abstract: The Myostatin protein (also known as GDF8) is a member of the transforming
growth factor-ß (TGF-ß) superfamily and is expressed almost exclusively in skeletal
muscle, both in the embryo and in the adult, where the protein circulates in the blood flow.
It was initially identified in 1997 by MCPHERRON et al., and since then many studies have
been demonstrating its essential role in the regulation of the development of skeletal
muscle from birds and mammals. The knockout of the Myostatin gene causes both
hyperplasia and hypertrophy of the skeletal muscle fibers, resulting in muscles twice as big
as the wildtype ones, thus showing that Myostatin is a negative regulator of skeletal
muscle deposition. The GDF8 structure and function is conserved in many species,
including humans where the Myostatin levels are increased during dystrophy conditions
and in the cachexia that accompanies some types of cancer and AIDS. A better
understanding of the mechanisms that rule the Myostatin expression is essential for the
development of strategies that might regulate its activity during such conditions. In this
research, we have identified, with the use of bioinformatic tools, the cis-regulatory
elements (promoter and enhancers) that regulate the Myostatin gene transcription. We
compared the GDF8 loci from human, chicken and mouse and found different evolutionary
conserved regions (ECRs), adjacent to the GDF8 coding sequence. Because these
intergenic sequences remained relatively conserved throughout evolution, they supposedly
have a functional role, possibly as cis-regulatory elements for the Myostatin gene. Our
analyses revealed the presence of seven possible enhancers downstream of the GDF8
gene and one conserved region upstream of it. In order to understand the role these
regions might have in the regulation of Myostatin's transcription activity, we searched for
binding sites that were also evolutionary conserved. Many conserved binding sites were
observed in the RECs downstream to the Myostatin gene, and among them are sites for
factors related to the development of the skeletal muscle (MyoD, Myogenin, E47, EN1),
limbs (Pax3, Tbx5) and heart (Nkx2.5, AREB6, Pitx2). Together, these data suggest a
modular regulation of the Myostatin gene during vertebrates' embryogenesis. The only
REC observed upstream of the Myostatin locus represents the putative basal gene
promoter. This hypothesis is strengthened by the presence of a binding site for the Tata
Binding Protein conserved for the studied species. In this research, we aimed at
functionally characterizing the Myostatin gene basal promoter. For that purpose, we
cloned the studied region in a promoterless vector, which contains GFP as a reporter
gene. This expression construct was then tested through in ovo electroporation assays.
The analysis of the electroporated embryos revealed that the cloned DNA region is
capable of driving the transcription of the reporter gene, which indicates that it truly
corresponds to the basal promoter of the Myostatin gene. Moreover, there are conserved
binding sites for the CREB and ATF1 transcription factors in the basal promoter, which are
activated by the cAMP signaling path. This finding is in agreement with recent studies that
demonstrate the involvement of cAMP in the regulation of the myogenic factors Myf5 and
MyoD, as well as Pax3, thus suggesting that the activity of the Myostatin gene might be
under the influence of this signaling path. Other regions of the human genome that have
a similar architecture to the one observed in the Myostatin promoter were identified. This
demonstrates that other genes are possibly under the influence of the same signaling path
regulating the activity of the Myostatin promoter, among them genes involved in
myogenesis and neurogenesis.
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