Resumo: Os biofilmes de Cândida albicans formados sobre a superfície de resina de poli (metil metacrilato) (PMMA) apresentam alta virulência em função da liberação de enzimas hidrolíticas e são responsáveis pela candidose oral, infecção fúngica mais comum em usuários de próteses dentais removíveis. A organização do biofilme em várias camadas celulares envoltos por matriz de polissacarídeos extracelulares leva estas camadas celulares a estado metabólicos diferenciados e, portanto o uso da técnica de redução XTT ( 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide), cuja reação é dependente da atividade celular, pode ser questionada. Assim, objetivou-se no primeiro estudo que compõem este trabalho, padronizar e aperfeiçoar esta técnica através da suplementação de glicose. Para isso, biofilmes de Cândida albicans ATCC 90028 com tempos de crescimento de 24, 48 e 72 h foram avaliados. Para estabelecer o melhor tempo de incubação do XTT, este foi mantido a temperatura de 37 °C, em tempos de 90, 180 e 270 minutos. A fórmula padrão do teste XTT (controle) foi modificada com a adição de 50, 100 e 200 mM de glicose para os grupos experimentais. Os melhores resultados para a incubação foram observados com tempo de 180 minutos e para a suplementação de glicose à concentração de 200 mM (p<0,001). Uma vez determinada a melhor condição de leitura da bioatividade dos biofilmes, foi idealizado o segundo estudo, que objetivou a mensuraçâo da bioatividade e a análise morfológica de biofilmes de Cândida albicans desenvolvidos sobre a superfície de PMMA. Duas resinas a base de PMMA (banho de água e microondas) foram utilizadas como substrato para o desenvolvimento de biofilmes de duas cepas de Cândida albicans (ATCC 90028 e SC5314). A atividade metabólica destes biofilmes foi mensurada com a técnica modificada de redução mitocondrial do XTT. A análise da morfologia da fase de adesão e dos biofilmes de 24, 48 e 72 horas foi avaliada com o auxilio do microscópio de varredura confocal a laser e o microscópio eletrônico de transmissão A combinação das análises da morfologia com a mensuraçâo da bioatividade, permitiu verificar o desenvolvimento do biofilme, desde a fase de adesão, com alta atividade metabólica, evoluindo para a constituição de uma comunidade microbiana de alta complexidade estrutural com a presença de matriz de polissacarídeos extracelulares, através da qual os nutrientes se difundem, porém dotados de pouca atividade metabólica. O método de ativação das resinas não interferiu na bioatividade do biofílme e com a morfologia do biofllme formado para a cepa de Candida albicans SC 5314. Com base nestes estudos concluiu-se que a incubação de 180 minutos utilizando a suplementação de 200 mM de glicose apresenta resultados de atividade metabólica celular com a menor variação para o estudo de biofilmes de Candida albicans e que a morfologia do biofílme de ambas as espécies foi fator fundamental para as diferenças na estrutura do biofílme Ver menos

Abstract: Candida albicans biofilms, developed on poly (methyl methacrylate) (PMMA) resin surfaces show high virulence index due to hydrolytic enzyme secretion and are responsible for oral candidosis in removable denture wearer. Since biofilms are surrounded by an extracellular polysaccharides matrix, the nutrients diffusion across the cell layers is difficulted, occasioning cell with different metabolic states. Thus, considering that the XTT reduction assay is dependent of cellular activity, its use for evaluating mature biofilms may lead to inaccuracies since biofilm bottom cells layers tends to be relatively quiescent at later stages of biofilm formation. The aim of the first study was the improvement of the XTT reduction assay by using glucose supplements in the standard XTT formulation. Candida albicans ATCC 90028 was used to form 24, 48 and 72 hours biofilm. The oxidative activity at 90, 180 and 270 minutes of incubation was evaluated. The standard XTT composition was modified by the addition of 50, 100 and 200 mM of glucose. The control comprised XTT formulation without glucose supplements. Biofilm growth yield after 180 min incubation, when evaluated with the 200 mM glucose supplemented XTT produced the most consistent readings on repetitive testing (pO.001), After the results of the determination of the oxidative activity assay using XTT supplemented by 200 mM glucose second study was conducted in which it was evaluated the characteristics of biofilm development of Candida albicans on two different poly (methyl methacrilate) resins (PMMA). Thus, two different Candida albicans strain (ATCC 90028 and SC5314) were allowed to develop its biofilm in two PMMA surfaces with different polymerization method: waterbath (WB) and microwave (MW). Different time points (adhesion, 24, 48 and 72 hours) were compared. Surface roughness (SR) and surface free energy (SFE) of PMMA specimens were previously measured. Oxidative activity was measured by XTT. Confocal images were used to measure bio-volume, thickness, biofilm roughness, diffusion and the of live/dead cells proportion in the different biofilm development stages. Cell counts were used to estimate the number of cells, and a combination of these techniques allowed to describe the Candida albicans biofilms development, starting from a small amount of cells with high oxidative activity, reaching to microbial community of complexity structural prosperities, with the presence of a matrix of polysaccharide, however with low oxidative activity. WB and MW showed no difference regards SR. and SFE means (p>0,05) and oxidative activity showed different results for each specie (p<0.001). Based on both studies, it can be conclude that 180 min incubation with the 200 mM glucose supplemented XTT generates more accuracy in oxidative activity results and also that the different polymerization method of PMMA are not able to interfere with biofilm development and main differences detected were related to the intrinsic characteristic of each Candida strain and biofilm development time Ver menos