Padronização da extração de DNA em papel filtro para a aplicação em amostras suspeitas de infecção perinatal pelo HIV-1
Tatiane Pedroso Kitamura
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP K646p
Campinas, SP : [s.n.], 2005.
140 p. : il.
Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: A Aids é causada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1). A infecção por este vírus tem diminuído significativamente entre a população pediátrica nos últimos anos, devido à atenção especial do Governo Brasileiro a pacientes infectados pelo HIV-1, entre eles as gestantes. A...
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Resumo: A Aids é causada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1). A infecção por este vírus tem diminuído significativamente entre a população pediátrica nos últimos anos, devido à atenção especial do Governo Brasileiro a pacientes infectados pelo HIV-1, entre eles as gestantes. A transmissão perinatal do HIV-1 pode ocorrer durante a gestação, na hora do parto ou após o parto, através do aleitamento materno. O diagnóstico da infecção pelo HIV-1 em adultos e em crianças com idade superior a 18 meses é usualmente estabelecido por ensaios sorológicos que identificam anticorpos específicos contra o HIV-1. Entretanto, o recém - nato adquire os anticorpos maternos da classe IgG, durante a gestação, o que pode levar a um diagnóstico falso-positivo nessa criança. O Ministério da Saúde no Brasil recomenda que o diagnóstico em crianças com idade inferior a 18 meses, seja feito através de técnicas de biologia molecular, pois estes detectam partículas virais e não os anticorpos contra o HIV-1. Um teste bastante eficiente é a reação em cadeia da polimerase (PCR), por ser um método de diagnóstico precoce, rápido, sensível, e que pode ter sua sensibilidade e especificidade elevada ainda mais com a realização de uma segunda reação de amplificação ("Nested-PCR"). A PCR detecta fragmentos - alvo do genoma viral, porém, para que as realizações das amplificações sejam satisfatórias, é necessária uma quantidade de sangue considerada de grande volume para recém - natos. Com base na necessidade de um diagnóstico precoce do HIV-1 e de uma melhor qualidade da amostra em pequenos volumes sangüíneos, este projeto teve como objetivo principal, a padronização da técnica de extração do DNA através de amostras sangüíneas colhidas em papel filtro, com utilização do kit FTA Cards (Life Technologies). Para confirmação da eficácia do método proposto foi realizada a técnica da "Nested-PCR", já previamente padronizada no laboratório onde foi desenvolvida a pesquisa, a partir de sangue periférico colhido com EDTA. Para a realização da PCR e "Nested-PCR" foram utilizados quatro pares de "primers" externos (PCR) e internos ("Nested-PCR") para genes que flanqueiam regiões conservadas do HIV-1 (gene gag, gene pol e duas regiões do gene env). Foram analisados 71 pacientes, sendo: 43 crianças com suspeita de infecção perinatal pelo HIV-1, 11 crianças e 14 adultos soropositivos (para controle positivo da reação) e 03 crianças negativas para infecção pelo HIV-1 (controle negativo da reação). Os resultados obtidos mostraram concordância entre os dois métodos de extração estudados, confirmando dados da literatura, onde há a afirmação de que a extração de DNA colhido em papel filtro é uma técnica que pode ser aplicada com sucesso para a realização da "Nested-PCR" em diagnóstico de crianças com suspeita de infecção perinatal pelo HIV-1
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Abstract: AIDS is caused by the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The infection by this virus in significantly falling between pediatric patients in the last years, mainly because the special interest of the Brazilian Government to the HIV-1 infected patients, especially the pregnant...
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Abstract: AIDS is caused by the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The infection by this virus in significantly falling between pediatric patients in the last years, mainly because the special interest of the Brazilian Government to the HIV-1 infected patients, especially the pregnant woman. The perinatal HIV-1 transmission may occur during the pregnancy, at the time of the birth, or after the birth during breast feeding. The diagnosis of HIV-1 infection in adults and children older than 18 months is usually defined by serological assays, which identify specific antibodies against HIV-1. However, the newborn acquire the IgG maternal antibodies during the pregnancy, which can result in a false positive diagnosis. The Brazilian Department of Health suggests that the diagnosis in patients younger than 18 months old could be defined with molecular biology, because these tests usually detects viral particles and not the HIV-1 antibodies. A very efficient test, the polimerase chain reaction (PCR), can define the diagnosis precocious, quick and sensible, and, in addiction, the performance of a second amplification reaction ('Nested-PCR") may elevate the sensibility and specificity of this test. The PCR detects fragments of the viral genoma, however, to obtain satisfactory amplifications, it is necessary a large volume of blood of the newborn. Based on the necessity of precocious diagnosis of HIV-1 and better quality of small blood volume sample, this project aim to standardize the technique of DNA extraction of blood sample obtained with filter paper, with the utilization of FTA Card kits (Life Technologies). To confirm the accuracy of this proposed method, it was applied the "Nested-PCR" technique, previously standardized in our laboratory, based on peripheral blood obtained with EDTA. To perform the PCR and "Nested-PCR", there were utilized four pairs of external (PCR) and internal ("Nested-PCR") primers to genes which flank conserved regions of HIV-1 (gag gene, pol gene and two regions of the env gene). There were studied 71 patients: 43 children with suspicious HIV-1 perinatal infection, 11 children and 14 adults, who were HIV-1 seropositive, and three children HIV-1 negative (control group). The results showed concordance between the two extraction methods studied, corroborating with the literature, which affirms that the DNA extraction obtained with filter paper is a technique that could be applied with success to perform "Nested-PCR" to the diagnosis of children with suspicious HIV-1 perinatal infection
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Padronização da extração de DNA em papel filtro para a aplicação em amostras suspeitas de infecção perinatal pelo HIV-1
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