FAK interage com MEF2 e ativa região intronica regulatoria do fosfolamban em resposta ao estimulo mecanico
Alisson Campos Cardoso
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP C179f
[FAK interacts with MEF2 and drives the stretch-induced activation of an intronic enhancer of phospholamban gene in cardiomyocytes]
Campinas, SP : [s.n.], 2008.
82f. : il.
Orientador: Kleber Gomes Franchini
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: Estudos anteriores demonstraram que em miócitos cardíacos submetidos a estímulos mecânicos ocorre pronta fosforilação e ativação da FAK. Resultados de estudos recentes, realizados em corações de ratos indicaram que em resposta a estímulos mecânicos, a FAK, além de ser ativada, localiza-se no...
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Resumo: Estudos anteriores demonstraram que em miócitos cardíacos submetidos a estímulos mecânicos ocorre pronta fosforilação e ativação da FAK. Resultados de estudos recentes, realizados em corações de ratos indicaram que em resposta a estímulos mecânicos, a FAK, além de ser ativada, localiza-se no núcleo dos miócitos cardíaco. Estudos conduzidos em corações de ratos Wistar adultos, utilizando a técnica de Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) com anticorpo anti- FAK, identificaram uma seqüência intrônica de 182pb do gene fosfolambam (plnil), contendo sítio para a ligação do fator de transcrição MEF2. Portanto, no presente estudo, investigamos se a região intrônica do gene que codifica o fosfolamban tem função regulatória transcricional. Utilizando técnicas de EMSA (Ensaio de retardamento da mobilidade eletroforética), ensaios de Precipitação e de gene reporter, avaliamos a interação entre a FAK e plnil além da função regulatória transcricional dessa seqüência. Como resultado, demonstramos que ocorre pronta ativação da FAK e seu acúmulo no núcleo de miócitos cardíacos de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a coarctação da aorta. Através de ensaios de EMSA, demonstramos que proteínas nucleares de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecarga pressórica, apresentaram um aumento na interação com a sonda plni1 em relação aqueles de ratos controles. Também, ensaios de EMSA indicaram uma interação entre MEF2 e a sonda plnil, mas não entre a FAK ou seus domínios (FERM e Cterminal) com a sonda plnil. Ensaios de precipitação com fragmentos recombinantes da FAK (GST-FERM e GSTCterminal) com extratos nucleares de coração de ratos coarctados indicaram uma associação entre FAK e MEF2. Ensaios adicionais demonstraram que a interação entre FAK e MEF2 é dependente do domínio Cterminal e do estado fosforilado da FAK. Estudos de transfecção com gene reporter, utilizando plasmídeo contendo a seqüência plnil, em cultura de miócitos cardíacos submetidos ao estiramento, demonstraram que a região intrônica plnil possui função regulatória transcricional e esse papel é dependente da ligação do fator de transcrição MEF2 ao seu sítio específico no DNA. Portanto, esses dados indicam que FAK e MEF2 podem estar envolvidos na regulação da expressão do gene pln através de regulação mediado pela região intrônica plnil.
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Abstract: Previous studies have shown that mechanical stress induces phosphorylation and activation of FAK in cardiac myocytes. Recent studies carried out in rat overloaded hearts indicated that FAK re-locates in the nucleus of the cardiac myocytes. By assays in the nuclei of overloaded cardiac...
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Abstract: Previous studies have shown that mechanical stress induces phosphorylation and activation of FAK in cardiac myocytes. Recent studies carried out in rat overloaded hearts indicated that FAK re-locates in the nucleus of the cardiac myocytes. By assays in the nuclei of overloaded cardiac myocytes with chromatin immunoprecipitation (ChIP) approach with anti-FAK antibody, we identified an intronic sequence of phospholamban gene (plnil), containing a MEF2 consensus site. In the present study, we investigated whether Plnil has any regulatory function in the pln. To accomplish this, we combinated techniques such as EMSA (Electrophoreses Mobility Shift Assay), reporter gene and pulldown assays. FAK
was shown to be rapidly activated and to accumulate in the nuclei of cardiac myocytes taken from overloaded left ventricle. Using EMSA assays, we demonstrated that nuclear extracts of left ventricle rats overloaded, interacted with the plnil probe. EMSA assays, also indicated an interaction between MEF2 and the plnil probe, but no interaction was found between FAK or its domains (FERM and Cterminal) with the plni1. Pulldown assays with FAK recombinant fragments (GST-FERM and GST-Cterminal) and nuclear extracts from left ventricle overloaded indicated that FAK and MEF2 physically interact through FAK Cterminal domain. Reporter gene assays, using a construction of plnil coupled luciferase transfected to cardiac myocytes culture underwent stretching, had demonstrated that the intronic region has transcriptional regulatory function and this role is dependent of the transcription factor MEF2 binding site in the DNA. Therefore, these data indicate that FAK and MEF2 interact in the nuclei of cardiac myocytes and that FAK/MEF2 complex may regulate phospholamban gene expression through the plnil. Ver menos
was shown to be rapidly activated and to accumulate in the nuclei of cardiac myocytes taken from overloaded left ventricle. Using EMSA assays, we demonstrated that nuclear extracts of left ventricle rats overloaded, interacted with the plnil probe. EMSA assays, also indicated an interaction between MEF2 and the plnil probe, but no interaction was found between FAK or its domains (FERM and Cterminal) with the plni1. Pulldown assays with FAK recombinant fragments (GST-FERM and GST-Cterminal) and nuclear extracts from left ventricle overloaded indicated that FAK and MEF2 physically interact through FAK Cterminal domain. Reporter gene assays, using a construction of plnil coupled luciferase transfected to cardiac myocytes culture underwent stretching, had demonstrated that the intronic region has transcriptional regulatory function and this role is dependent of the transcription factor MEF2 binding site in the DNA. Therefore, these data indicate that FAK and MEF2 interact in the nuclei of cardiac myocytes and that FAK/MEF2 complex may regulate phospholamban gene expression through the plnil. Ver menos
FAK interage com MEF2 e ativa região intronica regulatoria do fosfolamban em resposta ao estimulo mecanico
Alisson Campos Cardoso
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Alisson Campos Cardoso
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