Efeito de surfatantes e modificações metodologicas na solubilização de membrana mitocondrial interna de ratos analisada por eletroforese nativa e bidimensional
Elizabeth Sousa da Cunha
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP C914e
[Effect of surfactants and methodologic alterations in the rat inner mitochondrial membrane solubilization analysed by native and two dimensional electrophoresis]
Campinas, SP : [s.n.], 2008.
133p. : il.
Orientador: Eneida de Paula
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: A mitocôndria é uma organela vital, pois em células aeróbicas, ela é responsável pela produção da maior parte da energia química necessária para a célula. A síntese de ATP ocorre por fosforilação oxidativa na Fo,F1-ATPase, usando
a energia gerada pela cadeia de transporte de elétr ons, uma... Ver mais Resumo: A mitocôndria é uma organela vital, pois em células aeróbicas, ela é responsável pela produção da maior parte da energia química necessária para a célula. A síntese de ATP ocorre por fosforilação oxidativa na Fo,F1-ATPase, usando
a energia gerada pela cadeia de transporte de elétr ons, uma série de enzimas presentes na membrana mitocondrial interna. A análise de proteínas de membrana pode ser feita pela técnica de eletroforese, tanto em condições nativas quanto desnaturantes. Neste trabalho analisamos a solubilização de proteínas da membrana interna de mitocôndria de músculo de rato, através do uso de surfatantes zwiteriônicos (ASB-14, ASB-16, CHAPS), não-iônicos (Digitonina, C12E8, Triton X- 100) e aniônico (Colato de sódio) na separação por eletroforese em gel nativo e bidimensional. Desenvolvemos um novo protocolo para preparo de eletroforese em gel nativo, mantendo o tampão de amostra descrito no procedimento de BN-PAGE e adaptando as demais etapas da técnica de acordo com o protocolo de Laemmli et al (1970). Os géis assim preparados em temperatura ambiente mostraram melhor resolução que os pelo método BN-PAGE, foram obtidos menor tempo de corrida (1- 2 horas), sem troca de tampões e com emprego de reagentes de menor custo. Quanto a eficiência dos diferentes surfatantes, usados em uma mesma concentração (43,2 mM), o zwiteriônico ASB-16 foi o melhor solubilizador das proteínas de MMI, tanto em relação a quantidade total de proteína solubilizada como em relação a número de ¿spots¿ visualizados na eletroforese bidimensional, seguido pelo não-iônico Triton X-100. O surfatante não-iônico dodecil maltosídeo foi usado na preparações dos géis 2D em concentrações menores inferiores (20%) do que as indicadas na literatura (10% ou 195,8 mM), sem prejuízo da eficiência de solubilização protéica. Os resultados obtidos com géis nativos mostraram que todos os surfatantes estudados podem ser usados para separar os complexos protéicos da MMI, mas apresentam seletividade específica pelos complexos da Cadeia Respiratória, devendo esse parâmetro ser melhor estudado futuramente, para a determinação de protocolos específicos para isolamento dos diferentes tipos de complexos Ver menos
a energia gerada pela cadeia de transporte de elétr ons, uma... Ver mais Resumo: A mitocôndria é uma organela vital, pois em células aeróbicas, ela é responsável pela produção da maior parte da energia química necessária para a célula. A síntese de ATP ocorre por fosforilação oxidativa na Fo,F1-ATPase, usando
a energia gerada pela cadeia de transporte de elétr ons, uma série de enzimas presentes na membrana mitocondrial interna. A análise de proteínas de membrana pode ser feita pela técnica de eletroforese, tanto em condições nativas quanto desnaturantes. Neste trabalho analisamos a solubilização de proteínas da membrana interna de mitocôndria de músculo de rato, através do uso de surfatantes zwiteriônicos (ASB-14, ASB-16, CHAPS), não-iônicos (Digitonina, C12E8, Triton X- 100) e aniônico (Colato de sódio) na separação por eletroforese em gel nativo e bidimensional. Desenvolvemos um novo protocolo para preparo de eletroforese em gel nativo, mantendo o tampão de amostra descrito no procedimento de BN-PAGE e adaptando as demais etapas da técnica de acordo com o protocolo de Laemmli et al (1970). Os géis assim preparados em temperatura ambiente mostraram melhor resolução que os pelo método BN-PAGE, foram obtidos menor tempo de corrida (1- 2 horas), sem troca de tampões e com emprego de reagentes de menor custo. Quanto a eficiência dos diferentes surfatantes, usados em uma mesma concentração (43,2 mM), o zwiteriônico ASB-16 foi o melhor solubilizador das proteínas de MMI, tanto em relação a quantidade total de proteína solubilizada como em relação a número de ¿spots¿ visualizados na eletroforese bidimensional, seguido pelo não-iônico Triton X-100. O surfatante não-iônico dodecil maltosídeo foi usado na preparações dos géis 2D em concentrações menores inferiores (20%) do que as indicadas na literatura (10% ou 195,8 mM), sem prejuízo da eficiência de solubilização protéica. Os resultados obtidos com géis nativos mostraram que todos os surfatantes estudados podem ser usados para separar os complexos protéicos da MMI, mas apresentam seletividade específica pelos complexos da Cadeia Respiratória, devendo esse parâmetro ser melhor estudado futuramente, para a determinação de protocolos específicos para isolamento dos diferentes tipos de complexos Ver menos
Abstract: The majority of the chemical energy produced inside aerobic cells is a result of the oxidative phosphorylation of ATP, inside the mitochondria. A great part of mitochondria proteins are organized into complexes located in the inner mitochondria membrane. Isolation and identification of...
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Abstract: The majority of the chemical energy produced inside aerobic cells is a result of the oxidative phosphorylation of ATP, inside the mitochondria. A great part of mitochondria proteins are organized into complexes located in the inner mitochondria membrane. Isolation and identification of those proteins have been conducted by electrophoresis, both in native as in denaturant condition. In this work we analysed solubilization of the inner mitochondrial membrane proteins of rat¿s gastrocnemius muscles, through the use of zwitterionic (ASB-14, ASB-16, CHAPS), non-ionic (Digitonin, C12E8, Triton X-100) and anionic (sodium cholate),
by native and two-dimensional electrophoresis. We have developed a new protocol for the native gel electrophoresis, using the buffer sample described in BN-PAGE but changing other steps of the technique according to the protocol of Laemmli et al (1970). With this novel protocol, the gels prepared at ambient temperature had a better resolution than the classic BNPAGE technique; with low costs and short-time runs (1-2 hours). As for the effectiveness of surfactants studied to solubilize inner mitochondrial membrane proteins, when used at the same concentration (43.2 mM), the zwitterionic ASB-16 was the best, both accordingly to the total amount of solubilized protein, as for the number of "spots" detected in the two-dimensional electrophoresis, followed by non-ionic Triton X-100. The non-ionic surfactant dodecyl maltoside was used in the 2D electophoresys preparation at lower concentrations (20%) than that recommended in the literature (10% or 195.8 mM) without prejudice in the efficiency of protein solubilization. The results with native gels proved that all the studied surfactants can be used to separate the proteins of MMI, but with different selectivity for each enzymatic complex. This specificity should be better studied in the future, looking for the determination of specific protocols for better isolation of each types of MMI complex Ver menos
by native and two-dimensional electrophoresis. We have developed a new protocol for the native gel electrophoresis, using the buffer sample described in BN-PAGE but changing other steps of the technique according to the protocol of Laemmli et al (1970). With this novel protocol, the gels prepared at ambient temperature had a better resolution than the classic BNPAGE technique; with low costs and short-time runs (1-2 hours). As for the effectiveness of surfactants studied to solubilize inner mitochondrial membrane proteins, when used at the same concentration (43.2 mM), the zwitterionic ASB-16 was the best, both accordingly to the total amount of solubilized protein, as for the number of "spots" detected in the two-dimensional electrophoresis, followed by non-ionic Triton X-100. The non-ionic surfactant dodecyl maltoside was used in the 2D electophoresys preparation at lower concentrations (20%) than that recommended in the literature (10% or 195.8 mM) without prejudice in the efficiency of protein solubilization. The results with native gels proved that all the studied surfactants can be used to separate the proteins of MMI, but with different selectivity for each enzymatic complex. This specificity should be better studied in the future, looking for the determination of specific protocols for better isolation of each types of MMI complex Ver menos
Efeito de surfatantes e modificações metodologicas na solubilização de membrana mitocondrial interna de ratos analisada por eletroforese nativa e bidimensional
Elizabeth Sousa da Cunha
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