Resumo: o programa de seqüenciamento genômico da bactéria Xylella fastidiosa gerou um enorme número de ORFs ("Open Reading Frames" - quadro de leitura aberto ou genes putativos) pertencentes às categorias de patogenicidade, virulência e adaptação deste importante fitopatógeno. Uma destas ORFs (XF 1729) foi anotada como sendo uma fenilacetaldeído desidrogenase de 31,4 kDa. No entanto, a análise de sua seqüência primária de aminoácidos revelou similaridades com proteínas pertencentes à superfamília de aldo-ceto redutases. As proteínas desta superfamília são oxidorredutases NADPH-dependentes relacionadas funcionalmente e estruturalmente. Neste trabalho, a seqüência similar de X fastidiosa foi clonada no vetor de expressão pET32Xa/LIC com o objetivo de super expressar a proteína recombinante fusionada a seis resíduos de histidina em Escherichia colí BL21(DE3). A proteína expressa na fração solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado (resina Agarose-IDA-Ni). O conteúdo de sua estrutura secundária foi verificado por espectroscopia de dicroísmo circular. As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) forneceram os parâmetros estruturais gerais (raio de giro de 27,5 :I: 0,8 Á e máxima dimensão de 90 Á) e indicaram que a proteína apresenta-se como um monômero em solução. Além disto, os cálculos estruturais ab initio mostraram que a proteína apresenta algumas similaridades com uma aldo-ceto redutase previamente cristalizada. A proteína XF 1729 purificada foi capaz de catalisar a redução dos substratos DL-gliceraldeído (Kcat 2.26 S-l, Km 8.20:1: 0.98 mM) e 2-nitrobenzaldeido (Kcat 11.74 S-l, Km 0.14:1: 0.04 mM) na presença de NADPH. A seqüência de aminoácidos da proteína XFI729 apresentou mais alta identidade (maior que 40%) com inúmeras proteínas de função desconhecida. Entre as AKRs identificadas, encontramos aproximadamente 29% dê identidade com YakC (AKRI3) de Schizosaccharomyces pombe, 30% e 28% com AKRIIA e AKRIIB, ambas de Baci/lus subtiZis, respectivamente. Os resultados estabeleceram a proteína XF 1729 como um novo membro da superfamília das AKRs, da nova sub-família AKR13B 1. Finalmente, os experimentos de caracterização por cromatografia de gel filtração indicaram que a proteína apresenta wna forma alongada, gerando wn peso molecular aparente maior que o esperado. Além da proteína AKRl3B 1, selecionamos mais duas proteínas codificadas pelas ORFs XFl934 e XFl532 para estudos de estrutura e função. A proteína HetI (XFI934), de 22,4 kDa, apresenta similaridade proteínas da família phosphopantetheinyl transferase, sendo necessária à síntese de ácido graxo via acetato na bactéria. A proteína XF1532, de 36,8 kDa, é sirpilar a reguladores transcricionais de extresse oxidativo, sendo sua seqüência similar (44%) à proteína OxyR de Escherichia coZi, a qual pertence à família LysR de reguladores transcricionais. As duas ORFs foram clonadas e expressas em Escherichia coZi, no entanto não foi possível obter a proteína na fração solúvel, impossibilitando o seguimento dos estudos de caracterização estrutural e funcional. A descrição da metodologia utilizada para produção destas proteínas e os
resultados preliminares obtidos estão descritos no item Resultados Complementares desta tese. Um amplo benefício no conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da X fastidiosa tem sido esperado, desde o seqüenciamento completo de seu genoma. Neste sentido, passos iniciais foram dados no sentido de se caracterizar a função das proteínas codificadas por seus genes Ver menos

Abstract: The Xylella fastidiosa genome program generated a large number of gene sequences that belong to pathogenicity, virulence and adaptation categories from this important plant pathogen. One of these genes (XF 1729) was described in the genome annotation as being a phenylacetaldehyde dehydrogenase. However, the XF 1729 primary sequence analysis showed similarities to Aldo-keto reductase superfamily proteins. The AKRs are NADPH-dependent oxidoreductases structurally and functionally related. In this work, the similar sequence XF 1729 from Xylella fastidiosa was cloned onto the pET32Xa/LIC vector in order to over-express a
recombinant His- Tag fusion protein in E. coli BL21(DE3). The expressed protein in the soluble fraction was purified 'by immobilized metal affinity chromatography (agarose-IDA-Ni resin). Secondary structure contents were verified by circular dichroism spectroscopy. Small-Angle X Ray Scattering (SAXS) measurements furnish general structural parameters (the particle radius of gyration of 27.5:J::0.8A and the particle maximum dimension of 90A) and provide a strong indication that the protein has a monomeric form in solution. Also, ab initio calculations show that the protein has some similarities with a previously crystallized aldo-keto reductase protein. The recombinant XF1729 purified to homogeneity catalyzed the reduction ofDL-glyceraldehyde (Kcat 2.26 S-I, Km 8.20:J:: 0.98 mM) and 2-nitrobenzaldehyde (Kcat 11.74 S-I, Km 0.14:J:: 0.04 mM) in the presence of NADPH The amino acid sequence deduced from XF 1729 showed the highest identity (40% or higher) with several functionally unknown proteins. Among the identified AKRs, we found approximately 29% of identity with YakC (AKR13) from Schizosaccharomyces pombe, 30% and 28% with AKR11A and AKR11B, both from Bacillus subtilis, respectively. The results establish XF 1729 as the new member of AKR family, AKR13B1. Finally, the first characterization by gel filtration chromatography assays indicates that the protein has an elongated shape, which generates an apparent higher rnolecular weight. Since Xylellafastidiosa 9a5c strain (associated with CVC) is the first plant pathogen to be fully
sequenced, a large benefit for the whole field of disease research can be expected. An initial step has been taken towards the characterization the protein function encoded by its genes Ver menos