Imunolocalização e quantificação da proteina SP22 em espermatozoides de ovinos e sua relação com outros parametros espermaticos
Ana Paula Alves Favareto
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP F277i
[Immunolocalization and quantification of the SP22 protein on ovine sperm and its relationship to other sperm parameters]
Campinas, SP : [s.n.], 2008.
93f. : il.
Orientador: Wilma de Grava Kempinas
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Vários estudos têm demonstrado que a proteína espermática de membrana SP22 (22-28 kDa) é altamente correlacionada com a fertilidade. A localização desta proteína no segmento equatorial da cabeça espermática em várias espécies mamíferas, e a inibição de fertilização in vivo e in vitro, obtida...
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Resumo: Vários estudos têm demonstrado que a proteína espermática de membrana SP22 (22-28 kDa) é altamente correlacionada com a fertilidade. A localização desta proteína no segmento equatorial da cabeça espermática em várias espécies mamíferas, e a inibição de fertilização in vivo e in vitro, obtida com a incubação de espermatozóides com anticorpos anti-rSP22, sugerem sua participação na interação espermatozóide-oócito e sua importância para a capacidade reprodutiva masculina. Assim, os objetivos do presente estudo foram avaliar a presença da proteína SP22 em espermatozóides de carneiros adultos (raças Dorper e Santa Inês), identificando sua localização; quantificar os níveis desta proteína mediante as técnicas de ELISA e imunomarcação fluorescente utilizando anticorpo anti-rSP22; e correlacionar os seus níveis com os parâmetros espermáticos de morfologia, integridade de membrana avaliada por sondas fluorescentes (diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio), e cinética obtida por sistema computadorizado (CASA). A SP22 foi especificamente localizada no segmento equatorial da cabeça e no colo do espermatozóide ovino. As técnicas de ELISA e imunomarcação fluorescente mostraram-se eficientes para a quantificação da SP22 nos espermatozóides ovinos e altamente correlacionadas (R2 = 0,70). Não houve diferença significativa (P > 0,05) nos níveis de SP22 obtidos por estes dois métodos entre as raças estudadas. Para o estudo da cinética espermática foi realizada análise estatística multivariada, considerando os valores individuais obtidos pelo sistema CASA (1 ejaculado por carneiro, n = 3847 espermatozóides). Através da análise de agrupamento foi possível estabelecer um número de 3 sub-populações espermáticas coexistentes no ejaculado dos carneiros. A sub-população 1 foi a mais ativa e progressiva. A subpopulação 3 teve movimento pouco progressivo e não-linear, e a sub-população 2 teve um padrão de cinética intermediário. Houve diferença significativa (qui-quadrado = 824,39; grau de liberdade = 34; P < 0,0001) na distribuição das 3 sub-populações nos carneiros. No entanto, não houve correlação significativa (P > 0,05) entre a proporção de cada sub-população nos carneiros e os níveis de SP22 avaliados por ELISA e imunomarcação fluorescente. A integridade de membrana espermática foi positivamente correlacionada (R2 = 0,48; P = 0,02) com a proporção de espermatozóides da sub população 1 e negativamente correlacionada (R2 = 0,30; P = 0,02) com a sub-população 3. Porém, este parâmetro espermático não foi correlacionado (P > 0,05) com a proporção de espermatozóides da sub-população 2. Além disso, a morfologia espermática não foi correlacionada (P > 0,05) às proporções das três sub-populações cinéticas encontradas. Os níveis de SP22 obtidos por ELISA foram negativa e positivamente correlacionados (R2 para as 3 variáveis = 0,47) com as porcentagens de espermatozóides morfologicamente anormais e de espermatozóides com membrana plasmática íntegra, respectivamente. A quantificação de SP22 por análise de imunomarcação fluorescente não foi correlacionada com nenhum dos parâmetros espermáticos avaliados. Estes resultados demonstraram que o estudo da proteína SP22 em espermatozóides ovinos pode trazer importantes informações a respeito da capacidade reprodutiva destes animais. Entretanto, para a validação desta proteína como um biomarcador de fertilidade nesta espécie são necessários estudos que correlacionem os níveis da SP22 com as taxas de fertilidade obtidas in vivo e/ou in vitro
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Abstract: Several studies have shown that the SP22 sperm membrane protein (22-28 kDa) is highly correlated with fertility. The location of this protein on the equatorial segment of the sperm head in several mammallian species, and the inhibition of in vivo and in vitro fertilization, obtained by the...
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Abstract: Several studies have shown that the SP22 sperm membrane protein (22-28 kDa) is highly correlated with fertility. The location of this protein on the equatorial segment of the sperm head in several mammallian species, and the inhibition of in vivo and in vitro fertilization, obtained by the incubation of spermatozoa with anti-rSP22 antibodies, suggest its paticipation in spermatozoon-oocyte interaction and its importance for the male reproductive capacity. Thus, the goals of the present study were to evaluate the presence of the SP22 protein on spermatozoa from adult rams (Dorper and Santa Inês breeds), identifying its location; to quantify the levels of this protein by ELISA and FITC immunostaning analysis using anti-rSP22 Ig; and to correlate its levels with sperm parameters of morphology, membrane integrity evaluated by fluorescent probes (carboxyfluorescein diacetate and propidium iodide) and kinetics by computer-assisted sperm analysis (CASA). The SP22 was specifically located on the equatorial segment of the head and neck of the ram spermatozoon. The ELISA and FITC immunostaning techniques appear to be efficient for the SP22 quantification in ovine spermatozoa and were significantly correlated (R2 = 0.70). There was no significant difference (P > 0.05) in SP22 levels assessed by these two methods between the studied breeds. For the study of the sperm kinetics, multivariate statistical analysis was performed, considering the individual values obtained by CASA system (1 ejaculate per ram, n = 3847 spermatozoa). Through clustering analysis, it was possible to set up a number of 3 sperm subpopulations coexistent within ejaculate from rams. The subpopulation 1 was the most active and progressive. The subpopulation 3 had little progressive and non-linear movement and the subpopulation 2 had an intermediate kinetic pattern. There was significant difference (chi-square = 824.39; degrees of freedom = 34; P < 0.0001) in the distribution of the 3 subpopulations among the rams. However, there was no significant correlation (P > 0.05) between the proportion of each subpopulation in the rams and the SP22 levels evaluated by ELISA and FITC immunostaining analysis. The membrane integrity was positively correlated (R2 = 0.48; P = 0.02) with the proportion of spermatozoa in subpopulation 1 and it was negatively correlated (R2 = 0.30; p = 0.02) with subpopulation 3. However, this sperm parameter was not significantly correlated (P > 0.05) with proportion of spermatozoa in subpopulation 2. Moreover, sperm morphology was not significantly correlated (P > 0.05) with the proportions of the three kinematics subpopulations found within ejaculate semen. The SP22 levels obtained by ELISA were negatively and positively correlated (R2 = 0.47 for 3 variable) with percentages of spermatozoa morphologically abnormal and of spermatozoa with intact plasma membrane, respectively. The SP22 quantification by FITC immunostaning analysis was no correlated with any of the sperm parameters. These results showed that study of the SP22 protein in ram spermatozoa can bring important information about the reproductive capacity of these animals. Nevertheless, studies that correlate the SP22 levels with in vivo and/or in vitro fertility rate are necessary for validation of this protein as a fertility biomarker in this species
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