Analise dos nucleotideos ciclicos e sua associação com a produção de hemoglobina fetal na eritropoese in vitro e celulas CD34+ de pacientes com anemia falciforme
Carolina Lanaro
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP L22a
[Analysis of cyclic necleotides and their associations with the production of fetal hemoglobin in the in vitro erythropoesis of CD34+ cells from patients with sickles cell disease]
Campinas, SP : [s.n.], 2007.
137p. : il.
Orientador: Fernando Ferreira Costa
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: A anemia falciforme (AF) é causada pela substituição de uma única base no códon 6 do gene da globina beta (GAG - GTG), levando à produção de hemoglobina S. Estudos recentes têm mostrado que a ativação de guanilato ciclase (GCs) em linhagens de células eritrocíticas e em cultura primária de...
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Resumo: A anemia falciforme (AF) é causada pela substituição de uma única base no códon 6 do gene da globina beta (GAG - GTG), levando à produção de hemoglobina S. Estudos recentes têm mostrado que a ativação de guanilato ciclase (GCs) em linhagens de células eritrocíticas e em cultura primária de precursores da série vermelha, causa um aumento na transcrição do gene gama globina e conseqüentemente aumento na produção de hemoglobina fetal (Hb F) (Ikuta et al., 2001). Os nucleotídeos cíclicos, AMPc e GMPc são segundos mensageiros responsáveis por vários sinais extracelulares, incluindo hormônios e neurotransmissores e provavelmente têm papel importante na anemia falciforme regulando a produção de HbF. Este trabalho teve como objetivo, primeiramente, estabelecer um sistema de cultura de células CD 34+ e posteriormente investigar a existência de uma via NO-GMPc/AMPc envolvida na produção de Hb F nos eritrócitos de pacientes com anemia falciforme e verificar se haveria aumento da expressão de GCs e de gama globina nestes mesmos pacientes. Amostras de sangue foram coletadas de voluntários sadios e pacientes com anemia falciforme. Foi utilizado cultura de células CD34+ hematopoéticas de sangue periférico, e ao longo da diferenciação eritróide (7°, 10° e 13° dia) foram coletadas células para citometria de fluxo, citospin, dosagem de GMPc e AMPc e avaliação da expressão gênica de gama globina, GCs alfa e beta subunidades, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B e CD49. Observamos que gama globina encontra-se significativamente mais expressa nas culturas falciformes no 13° dia de diferenciação eritróide em relação ao mesmo ponto das culturas controle (2,945 ± 0,303 x 1,445 ± 0,165, respectivamente ,p=0,0095, n=6). A expressão de GCs alfa e beta subunidades, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B e CD49 não apresentou diferenças significativas durante a diferenciação eritróide nas culturas falciformes e controles. Os níveis de GMPc nas culturas de pacientes com anemia falciforme estavam significativamente diminuídos ao longo da eritropoese in vitro em comparação com as culturas controles (dia 7: 0,2765 ± 0,0527 x 0,639 ± 0,1221 (p=0,0260); dia 10: 0,1166 ± 0,0219 x 0,268 ± 0,1181; dia 13: 0,037 ± 0,0061 x 0,093 ± 0,0236 (p=0,0152), respectivamente), enquanto o AMPc, encontrava-se elevado no dia 7 das culturas falciformes em relação às culturas controles (dia 7: 72,017 ± 14,849 x 24,987 ± 13,497 (p=0,048); dia 10: 36,3384 ± 16,708 x 8,663 ± 4,591; dia 13: 1,7138 ± 1,093 x 0,680 ± 0,370, respectivamente). O tratamento com BAY 41-2272 (ativador de GCs) em única cultura controle aumentou aproximadamente 3x os níveis de gama globina após 72 h de incubação. Nossos resultados sugerem que as células tronco hematopoéticas dos pacientes com AF são diferentes às dos controles, uma vez que ambas, sob as mesmas condições in vitro expressaram níveis significativamente diferentes de gama globina. Um cross talk entre o GMPc e o AMPc poderia regular a expressão de gama globina ao longo da diferenciação eritróide. Estes dados resultam no primeiro trabalho a demonstrar a expressão basal de gama globina ao longo da diferenciação eritróide de pacientes com anemia falciforme. Desta maneira, o esclarecimento desta via pode contribuir com entendimento da fisiopatologia da anemia falciforme e identificar novos alvos para a regulação farmacológica de hemoglobina fetal
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Abstract: Sickle cell disease (SCD) is caused by the substitution of a single base in codon 6 of the beta globin gene (GAG-GTG), causing the production of S hemoglobin. Recent studies have demonstrated that the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) in erythrocytic cell lines and in primary...
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Abstract: Sickle cell disease (SCD) is caused by the substitution of a single base in codon 6 of the beta globin gene (GAG-GTG), causing the production of S hemoglobin. Recent studies have demonstrated that the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) in erythrocytic cell lines and in primary erythroid precursor culture causes an increase in the transcription of the gamma globin gene and, consequently, an augmented production of fetal hemoglobin (HbF) (Ikuta et al., 2001). The cyclic nucleotides, cAMP and cGMP, are second messengers that are responsible for mediating the signaling of various extracellular signals, including those of hormones and neurotransmitters and, probably, have an important role in SCD by regulating the production of HbF. This study aimed to investigate the existence of a NO-cAMP/cAMP pathway involved in the production of HbF in the erythroid cells of patients with SCD and to determine whether there is an increase in the expression of sGC and of gamma globin in these same patients. Blood samples were collected from healthy volunteers and SCD patients. Peripheral blood hematopoietic CD34+ cell culture was used for the investigation; cells were differentiated into erythroid lineage and cells collected (7th, 10th and 13th day) for flow cytometry, citospin, measurement of cGMP/cAMP and evaluation of the gene expression of gamma globin, the sGC alpha and beta subunits, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B and CD49. We demonstrate that gamma globin was significantly more expressed in the cultures of SCD cells on the 13th day of erythroid differentiation compared to the same time point in control cells (2.95 ± 0.30 vs. 1.45 ± 0.17, respectively, p=0.0095, n=6). The expression of sGC alpha and beta subunits, eNOS, PDE3B, CD36, CD29B and CD49 did not present significant differences during erythroid differentiation in control or SCD cell cultures. Levels of cGMP were significantly decreased during erythropoiesis in the SCD cultures compared to control cultures (day 7: 0.277 ± 0.053 vs. 0.639 ± 0.122 (p=0.026); day 10: 0.117 ± 0.022 vs. 0.268 ± 0,118; day 13: 0.037 ± 0.006 vs. 0.093 ± 0.024 (p=0.015), respectively). In contrast, levels of cAMP were significantly increased in the SCD cultures compared to the control cultures (day 7: 72.02 ± 14.85 vs. 24.99 ± 13.50 (p=0.048); day 10: 36.34 ± 16.71 vs. 8.66 ± 4.59; day 13: 1.74 ± 1.09 vs. 0.680 ± 0.370, respectively). Treatment with BAY 41-2272 (sGC inducer) in a single control cell culture increased the levels of gamma globin by approximately 3 times after 72h of incubation. Results suggest that the hematopoietic stem cells of SCD patients are significantly and constitutively different to those of controls, since under the same in vitro culture conditions, differentiation of the two cell types results in consistently significant different levels of gamma globin. A cross talk between cGMP and cAMP may regulate the expression of gamma globin during erythroid differentiation in patients with SCD. Thus, further investigation of this pathway may contribute to the understanding of the physiopathology of the disease and identify new targets for the pharmacological regulation of HbF production
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Costa, Fernando Ferreira, 1950-
Orientador
Fabron Junior, Antonio
Avaliador
Melo, Mônica Barbosa de, 1968-
Avaliador
Sonati, Maria de Fátima, 1958-
Avaliador
Annichino-Bizzacchi, Joyce Maria, 1957-
Avaliador
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Carolina Lanaro
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