Resumo: O leite bovino contém várias proteínas que são consideradas antigênicas e capazes de induzir resposta imune, dentre elas, a ß-lactoglubulina (ß-Lg) é uma das mais antigênicas. A enzima transglutaminase (TG) é a única enzima utilizada comercialmente que catalisa reação de ligação cruzada inter ou intramolecular em diversas proteínas, formando polímeros de alta massa molar. Até o momento, pouco se conhece sobre a modificação dos epítopos antigênicos na estrutura das proteínas do soro de leite modificada ou polimerizada pela enzima TG. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da reação de polimerização induzida pela TG na atividade antigênica da ß-Lg. A modificação da ß-Lg com a TG foi realizada em dois experimentos: (1) a ß-Lg foi tratada termicamente (80 °C/60 min) em diferentes concentrações (3, 5 e 7%) e polimerizada com TG (5, 10, 25 e 50 U/g de proteína) e (2) a ß-Lg (3, 5 e 7%) foi polimerizada com TG 25 U/g de proteína na presença de agente redutor Cys nas concentrações 0,05, 0,1, 0,25 e 0,4 mol/L. A caracterização da ß-Lg polimerizada foi realizada por eletroforese (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (CLAE-EM). A antigenicidade da proteína foi avaliada por métodos imunoquímicos, utilizando soro de camundongos BALB/c e técnicas de Immunoblotting e ELISA. Quando a ß-Lg 3% foi tratada termicamente e polimerizada com TG, 40% da ß-Lg permaneceu nas formas monomérica e dimérica. Já as amostras tratadas com maior concentração de proteína (5% e 7%) apresentaram de 70% a 87% de material com massa molar (MM) > 100 kDa, sendo que ß-Lg 7% polimerizada com 25U TG/g foi a que apresentou maior grau de polimerização. Na presença de Cys, observou-se maior percentual de produtos com MM > 100 kDa que o obtido com o tratamento térmico. Nas amostras ß-Lg 5% e ß-Lg 7%, a presença da Cys possivelmente aumentou a susceptibilidade da ß-Lg à polimerização. As amostras selecionadas para avaliação da antigenicidade foram ß-Lg nativa, ß-Lg 7% tratada termicamente e polimerizada com 25U TG/g de proteína (ß-Lg 7% TT 25TG) e ß-Lg 7% polimerizada com 25 U/g de proteína na presença de Cys 0,25 mol/L (ß-Lg 7% 0,25Cys TG). Os resultados mostraram que os animais sensibilizados com ß-Lg polimerizada na presença de agente redutor Cys apresentaram níveis séricos de IgE e IgG menores, comparados aos grupos imunizados com ß-Lg nativa e ß-Lg tratada termicamente e polimerizada com TG, sugerindo que a polimerização na presença de agente redutor Cys pode reduzir o potencial antigênico da proteína ao modificar .e/ou ocultar regiões de epítopos na proteína Ver menos

Abstract: The bovine milk contains several proteins that are considered antigenic and capable of inducing immune responses, among them ß-lactoglubulin (ß-Lg) is one of the most antigenic protein. The enzyme transglutaminase (TG) is the only enzyme commercially used that catalyzes reaction of crosslinking inter or intramolecular in several proteins, forming polymer of high molecular mass. Up to now, little is known about modification of epitopes of whey proteins by the TG. The present study examines the effect of the polymerization reaction induced by TG on the antigenic activity of ß-Lg. The ß-Lg was modified by TG in two experiments: (1) ß-Lg was heat treated (80 °C/60 min) at different concentrations (3, 5 and 7%) and modified with TG (5, 10 , 25 and 50U / g protein), and (2) ß-Lg (3, 5 and 7%) was modified with TG 25U / g of protein in the presence of reducing agent Cys ( 0.05, 0.1, 0.25, 0.4 mol/L). The characterization of the modified ß-Lg was performed by electrophoresis (SDSPAGE) and high performance liquid chromatography molecular exclusion (HPLCMS). The antigenicity of the protein was measured by Immunoblotting and ELISA, using serum from BALB/c mices. When ß-Lg 3% was heat treated and modified by TG, 40% of the ß-Lg remained as monomeric and dimeric forms. However, the samples treated at higher protein concentration (5% and 7%) showed 70% to 87% of material with molecular weigh > 100 kDa. ß-Lg 7% modified with 25U TG / g presented the greatest degree of polymerization. In the presence of Cys, higher percentage of products with MW > 100 kDa was obtained than with the previous heat treatment. The presence of Cys increased the susceptibility of ß-Lg for polymerization, especially those treated at protein 5 and 7% concentrations. The samples selected for evaluation of the antigenicity were native ß-Lg, 7% ß-Lg treated with 25U TG / g of protein (ß-Lg 7% TT 25TG) and 7% ß-Lg treated with 25U TG / g protein in the presence of Cys 0.25 mol / L (ß-Lg 7% 0.25 Cys TG). The results showed that animals sensitized with ß-Lg in the presence of reducing the agent Cys had lower levels of IgG and IgE, compared to the groups immunized with native ß-Lg and ß-Lg treated with high temperature and modified with TG, suggesting that the polymerization in the presence of reducing agent Cys can modify or hide epitopes and reduce the potential antigenic of the protein Ver menos