Resumo: o sucesso da implantação e desenvolvimento embrionário em animais de placentação do tipo hemocorial requer além da presençafísica do embrião/feto,uma dinâmica de alterações seqüenciais na interface materno-fetal do útero gestante. Tais alterações são mediadas e controladas pelas ações sincronizadas de uma série de fatores de efeito endócrino, parácrino e autócrino, com o comprometimento de diversas células presentes nesta interface. Dentre as peculiaridades do útero gestante, o recrutamento e o acúmulo de células uNK têm sido apontado como de fundamental importância na modulação da homeostase da interface materno-fetal para o desenvolvimento normal da gestação. Por outro lado, a complexidade das múltiplas interações célula-célula e citocinas-células que modulam a interação materno-fetal, dificulta a compreensão plena dos mecanismos envolvendo a participação das células uNK na imunomodulação do útero gestante. Portanto, procuram-se por procedimentos que permitam as análises do comportamento das células uNK em condiçõesexperimentais controladas,assim como, elucidar tanto as vias da ativação, quanto da inibição das atividades moduladorasdestas células na gestação. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo experimental de cultivo de células uNK avaliando desde a viabilidade das células isoladas do útero de camundongos gestantes e, testando diversas condições para manipulação e manutenção in vitro destas células. Foram aprimorados os procedimentos de isolamento positivo e purificação das células uNK de camundongos pelo método da esfera magnética revestida com lectina DBA. Foram conduzidos testes quanto aos efeitos dos componentes da matriz extracelular -fibronectina, laminina e colágeno I na sobrevida destas células e, quanto aos efeitos isolados e combinados das interleucinas IL-2, IL-15 e GM-CSF e, das quimiocinas MIP-1j3e CXCL10. Para otimização dos procedimentos destes ensaios, foi desenvovido um protocolo de cultivo em micro-spots, visando manipular células em escala mínima (5x103 células) com
reprodutibilidade e sensibilidade que permitisse a padronização dos ensaios in vitro. Dentre os componentes da matriz extracelular testados, a fibronectina proporcionou a manutenção de maior número de células viáveis pelo período de até sete dias de cultivo, enquanto a citocina IL-15 promoveu a diferenciação das células uNK notadamente pelo aumento de grânulos citoplasmáticos. A quimiocina MIP-1j3 induziu a migração de células in vitro, enquanto a CXCL10 teve um efeito inibidor desta ação do MIP-1j3. Por outro lado, as análises quantitativas mostraram que a combinação da CXCL10 e IL-15 manteve o maior número de células uNK aderidas ao substrato de fibronectina em períodos prolongados de cultura, alem de promover a diferenciação destas células. A integridade e viabilidade das células uNK pode ser comprovada pela amplificação de transcriptomas isoladas de 5x103 células através do RT-PCR. Porém, as reações imunocitoquímicas com anti-PCNA não demonstraram qualquer atividade proliferativa nas células uNK mantidas nestas condições de cultivo.Estes resultados demonstram a adequação deste protocolo de cultivo em microspot para diversos ensaios in vitro com as células uNK isoladas de camundongos mesmo em pequenas quantidades e, um protocolo inovador para estudos da fisiologia destas células em situações experimentais controladas Ver menos

Abstract: The success of embryo implantation and development in the animais of hemochorial type placentation requires beside the presence of the embryo/fetus properly,a dynamic sequential changes at the maternal-fetal interface in the pregnant uterus. These changes are mediated and controlled by synchronized actions of many endocrine, paracrine and autocrine factors with commitment of several cells present at this interface. Among the peculiar features of normal pregnant uterus, the uNK cells recruitment and accumulation has been hallmarked as essential to modulate the maternal-fetal interface homeostasis. Otherwise, the complexity of
multiple cell-cell and cytokine-cells interactions involved at the maternal-fetal interaction of pregnant uterus, make difficult the fully understanding of mechanisms related to the participation of uNK cells in the immunomodulation of pregnant uterus. Therefore, it is widely expected to establish and experimental procedures that benefit the analysis of uNK cells behavior under controlled condition and those allowing elucidation of both activation and inhibition of modulator activities of these cells. The present work aimed to establish an experimental model of uNK cells culture evaluating since the viability of isolated from pregnant mouse uterus and testing several conditions for in vitro manipulation and maintenance of these cells. There were improved the procedures of positive isolation and purification of mouse uNK cells by OSAlectin coated magnetic-beadmethod. Tests regarding the effects of extracellular matrix components - fibronectin, lamminin and collagen I on surviving of these cells and effects of interleukin IL-2, IL-15 and GM-CSF and, chemokines MIP-1[3and CXCL10 alone or in combination were perfomerd.To optimize the procedures of these in vitro assays, it was set up a protocol of micro-spot culture for manipulation of minimal scale (5.103cells) of cells with reproducibility and sensibility. Among the extracellular matrix components, the fibronectin promoted the maintenance of highest proportion of viable cells during seven days culture, while the cytokine IL15 induced the uNK cell differentiation noticeable by increasing of cytoplasmatic granules. The chemokine MIP-1[3induced the cell migration in vitro, while CXCL-10 inhibited the effect on MIP-1[3.On the other hand, the quantitative analysis showed the combination of CXCL-10 and IL-15 maintained the largest number of uNK cells for longest time adhered on fibronectin-coated cultures, as so as, the differentiation of these cells. However, the PCNA immunocytochemistry did not show any
proliferation activity of uNK cells in culture. The integrity and viability of uNK cells in culture was confirmed by RT-PCR of transcriptomes obtained from 5.103 cells. These results confirm the adequacy of micro-spot culture as new insight using small number of uNK cells for in vitro assays and the establishment of required conditions to maintain these cells in primary culture to study their physiology under controlled experimental conditions Ver menos