Resumo: No presente estudo analisou-se a expressão gênica por microarray em 17 casos de Leucemia Mielóide Aguda (LMA), 5 casos de Leucemia Linfóide Aguda (LLA), tendo como controle 4 amostras de células progenitoras de sangue periférico coletadas de doadores de transplante de medula óssea após estimulação com G-CSF. Para isto foram utilizadas membranas de microarray contendo cerca de 4700 fragmentos de cDNA correspondendo a genes conhecidos ou a ESTs, construídas no Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer/FAPESP a partir dos clones de cDNA gerados pelo Projeto Genoma Humano do Câncer. Suas principais vantagens são (1) a utilização da metodologia ORESTES na construção da biblioteca de ESTs, o que a torna mais representativa da parte central dos genes; (2) ser desenvolvida com clones cDNA provenientes do Projeto Genoma Humano do Câncer e, portanto, com potencial de conter genes não disponíveis nas membranas comerciais e, (3) sendo produzida a partir de tecidos neoplásicos variados, teoricamente pode apresentar seqüências relacionadas à tumorigênese. A metodologia foi eficiente na caracterização de um conjunto de genes diferencialmente expressos nas amostras de LMA, LLA, LMA subtipo M3 e dos casos-controle, pela análise estatística pelo método de Wilcoxon e clusterização hierárquica supervisionada e não-supervisionada desenvolvidas por Eisen. Na comparação entre LMA e LLA, sob o aspecto funcional, foi possível observar genes particularmente afetados relacionados a processos celulares específicos, como as vias de regulação do metabolismo de nucleotídeos, adesão e sinalização celulares (SS2XIP, MUC4, THBS1 e RGL2), transdução de sinal especialmente pela via Wnt e via Ras e Rho das ?small GTPases? (RGL2, ARGHAP1 e CDKN1B e beta-catenina) entre as LMA, e um conjunto de genes reguladores apoptóticos como os genes BIRC6, SH3GLB1, PSEN1 e NFKB1 entre as LLA. Os microarrays evidenciaram resultados importantes na separação de genes relacionados às LMA-M3 e às LMA-não M3, mostrando expressão diferencial de genes antes não associados ao subtipo específico M3, tais como TLE1, PSCDBP, SMG1, TALDO1, CUL1, TBX1 e UBXD8), alguns relacionados à regulação do ciclo celular e morte programada, e componentes do complexo Groucho/TLE que funciona como repressor da atividade transcricional induzida pela via Wnt.Os resultados foram validados através da utilização de PCR em tempo real em 5 genes selecionados e testados em uma população maior de casos (n=50 amostras de leucemias). Em 4 destes genes, os resultados foram completamente confirmados, demonstrando que a tecnologia de microarrays foi eficiente no rastreamento de genes potencialmente relacionados aos de subtipos de Leucemias Agudas, em especial as LLA e as LMA-M3, nesta membrana 3.7K do Instituto Ludwig/FAPESP. Assim, a utilização da metodologia de microarray com seqüências derivadas do Projeto genoma do Câncer (Instituto Ludwig/FAPESP) permitiu a discriminação de vias metabólicas importantes no processo de tumorigênese, alguns até mesmo associados a tipos leucêmicos específicos, e o reconhecimento de genes diferencialmente expressos antes não descritos na literatura Ver menos

Abstract: The development of gene expression assays, such as cDNA microarrays, has permitted the simultaneous study of several genes; one of this methods is the cDNA microarrays. These investigations contribute to the classification of diseases, comprehension of tumoral biology and, finally, the determination of genetically related prognostic factors. In this present study, the gene expression profiles were analysed for 17 cases of Acute Myeloid Leukemia (AML), 5 cases of Acute Lymphocytic Leukemia (ALL) and 4 samples of peripheral blood apheresis, after stimulation with G-CSF for alogenic transplantation donors. For the microarray assays, membranes containing approximately 4700 spots were developed by the Ludwig Institute for Cancer Research, with contribution and financial support of FAPESP, using cDNA cloned from the Human Cancer Genome Project. The main advantages of these membranes include (1) availability of a cDNA library constructed by the ORESTES methodology, which makes the cDNA clones more representative of the whole transcriptome, (2) the non-comercial characterization of human transcripts, which may be vantageous for finding new genes and/or ESTs not diffusely disponible in large-scale production and, (3) since the library is contructed from different tumoral tissues, it may constitute the best representation of the tumorigenesis process. The methodology efficiently distinguished a group of genes, supporting the identification of the ALL, AML and control samples by the Wilcoxon Statistical Analysis and the supervised and non-supervised Hierarchical Clusterization developed by Eisen. Among the genes that were differentially expressed when comparing AML and ALL, it was possible to observe genes related to specific cellular processes such as: in the AML group nucleotides metabolism regulation pathways, adhesion and cell signaling (SS2XIP, MUC4, THBS1 e RGL2), signal transduction, especially in the Wnt pathway and Ras and Rho from the ?Small GTPases? pathway (RGL2, ARGHAP1, CDKN1B and beta-catenin), and in the ALL a group of apoptotic regulators genes such as BIRC6, SH3GLB1, PSEN1 e NFKB1 among. The microarray efficiently to distinguished genes related to M3-AML and non-M3-AML, showing differentially expressed genes not previosly described in the literature to be related to the specific sbtype M3-AML, such as TLE1, PSCDBP, SMG1, TALDO1, CUL1, TBX1, UBXD8, genes associated with programmed cell death and cell cycle, and components of Groucho/TLE complex, which functions like a repressor of transcriptional activity induced by the Wnt pathway. The results were validated through the utilization of Real Time PCR in five selected genes, tested in a greater number of cases (n=50 acute leukemia samples). In 4 of these genes the results were completely confirmed, demonstrating that the microarray technology with the 3.7K Ludwig Institut/FAPESP membranes was efficient for screening genes possibly related to specific leukemias subtypes, particularly the ALL and M3-AML groups. As such, the utilization of microarray methodology with sequences derived from the Cancer Genome Project (Ludwig Institut/FAPESP) permitted the distinction of important metabolic pathways for the tumorigenesis process, some of them associated to specific leukemic subtypes, and the recognition of differentially expressed genes not before described in the literature Ver menos