Resumo: A utilização de métodos inovadores de estabilização microbiológica em alimentos como alternativa ao método térmico tem se mostrado promissora para a obtenção do melhor compromisso entre segurança e qualidade. Alta pressão dinâmica e bioproteção são tecnologias inovadoras: alta pressão dinâmica (APD) ou homogeneização por ultra alta pressão (HUAP) utiliza-se de sistemas de compressão de fluido a pressões superiores a 100MPa, para então forçar o fluido através de uma estreita fenda causando brusca aceleração e forças de cisalhamento resultando na ruptura de células de microrganismos; bioproteção, por sua vez, consiste no emprego de substancias naturais ou produzidas a partir de fontes alimentícias com atividade antimicrobiana para a estabilização microbiológica de alimentos e processos. Concentrações inibitórias mínimas (MIC) de nisina, lisozima, extrato de lúpulo e sakacina foram medidas contra Lactobacillus brevis e delbruecki, Acetobacter aceti, Pediococcus sp. e duas cepas de leveduras selvagens. Nisina foi capaz de inibir o crescimento de Pediococcus sp (2,0 mg.L-1), L. brevis (3,0 mg.L-1) e L. delbruecki (0,8 mg.L-1), no entanto, o A. aceti não foi inibido até concentrações de 0,2 g.L-1. Lisozima inibiu L. delbruecki (1,0 mg.L-1) e exibiu uma inibição transitória sobre L. brevis (50 mg.L-1). Alta pressão dinâmica foi empregada sobre os mesmos microrganismos a pressões de 60, 100, 150, 250 MPa em cerveja (pH 4,5; 2,5oP; 4,7oGL). O valor de Dp, taxa de redução logarítmica do microrganismo mais resistente foi calculada. Um experimento de múltiplas passagens foi realizado a pressões subletais até 3 passagens pelo sistema. Todas as linhagens foram inativadas a pressões de até 250 MPa, mesmo em contagens iniciais altas da ordem de (106UFC/mL). L. delbruecki foi a linhagem mais resistente com um Dp de 38,9 MPa. No ensaio de múltiplas passagens pelo sistema foi observado que o efeito de tratamentos consecutivos resultou em um efeito aditivo, não tendo sido observado sinergismo ou antagonismo por seleção de bactérias resistentes. Foi avaliado o efeito da temperatura de entrada (6, 10, 20, 23, 30, 44, 50oC) e concentração de CO2 na cerveja (0; 0,5; 1,0 e 2,0 volumes a 25oC) na destruição de L. delbruecki, a 150 e 170 MPa. A temperatura de entrada causou um efeito positivo sobre a destruição e 3 ciclos logarítmicos de diferença no número de reduções decimais foi observado entre 6 e 50°C. Por sua vez, a concentração de CO2 causou um efeito negativo sobre a destruição. Lactobacillus brevis, um dos microrganismos mais resistentes ao tratamento de cerveja por alta pressão, foi utilizado nos estudos de efeito combinado entre alta pressão dinâmica e bioproteção, uma vez que L. delbruecki apresentou alta sensibilidade aos antimicrobianos. A inibição pela lisozima foi transitória e a adição de 50 mg.L-1 foi capaz de reduzir um ciclo logarítmico da contagem após duas horas de contato. O tratamento por alta pressão dinâmica da suspensão de L.brevis resultou em uma redução de sete ciclos logarítmicos a 200 MPa. Lisozima mostrou-se resistente ao processo APD, não perdendo atividade enzimática ou antimicrobiana até a pressão de 200 MPa. Um tratamento combinado utilizando 50 mg.L-1 e APD (150 a 170 MPa) resultou em uma redução de 6 ciclos logarítmicos estabilizando a contagem após o tratamento por uma semana em tampão fosfato, a temperatura ambiente (25°C). L. brevis foi inoculado a seguir em cerveja a uma concentração de 106 UFC/mL, em presença de 100mg.L-1 de lisozima e reservado por uma hora. A suspensão foi dividida em alíquotas e cada uma tratada por alta pressão dinâmica a 100 e 140 MPa. A contagem de viáveis em cada uma das etapas mostrou que a lisozima promoveu uma destruição de um ciclo seguida de um e quatro ciclos logarítmicos devido ao tratamento por alta pressão a 100 e 140 MPa, respectivamente. Uma completa redução da carga inicial foi observada ao final de 10 dias a temperatura ambiente em cerveja nas amostras tratadas por pressão. Nisina por si só provou ser um bioprotetor eficaz no controle de Lactobacillus em cerveja, e mostrou-se resistente ao processo de alta pressão. O efeito do processo de alta pressão dinâmica sobre a qualidade da cerveja foi avaliado. Cerveja tipo pilsen, não filtrada e não estabilizada físico-quimicamente foi submetida ao tratamento por alta pressão entre 100 e 300 MPa. Foi medida a cor e turbidez segundo os padrões Cie L*a*b* e ASBC/Hunterlab. Foi realizado um teste de vida útil por 100 dias após tratamento de cerveja a 250 MPa, medindo-se o potencial óxido redutor, a turbidez e cor (ASBC), periodicamente (aproximadamente mês a mês). Os resultados mostraram que o processo foi efetivo na retenção da cor mas a turbidez foi aumentada em 5 vezes em tratamentos a pressão de 300 MPa. Também o teste de vida útil resultou em boa retenção da cor durante o período e do potencial de óxido redução, mas a turbidez aumentou a 140 FTU (Formazin Turbidity Units) em um mês e um precipitado foi formado. Alta pressão dinâmica provou ser um método eficiente na estabilização microbiológica de cervejas, e pode ser eficientemente associada a outros métodos de controle como a bioproteção. Se por um lado microrganismos Gram negativos foram resistentes aos bioprotetores utilizados, esses se mostraram mais susceptíveis ao tratamento por alta pressão tornando os métodos combinados complementares. Novos trabalhos devem ser realizados com cerveja filtrada e estabilizada físico-quimicamente, para se avaliar se a redução de pressão devido à combinação de tratamentos resultaria em produtos com boa qualidade, principalmente no que se refere à turbidez Ver menos

Abstract: The use of novel microbial stabilization techniques as alternatives to thermal treatments are promising solutions for a compromise between quality and safety. As such, dynamic high pressure and biopreservation are novel techniques: dynamic high pressure (DHP or ultra high pressure homogenization (UHPH) is a technology that uses fluid compression to reach pressures higher than 100 MPa in order to acceleratethe passage of the fluid through a narrow gap, causing shear and stress to the microorganism cell structure and resulting in cell disruption; biopreservation consists in the employment of naturally occurring or biologically produced substances with antimicrobial activity in order to impart microbiological stability to a food product or food manufacturing process. This work aimed to evaluate the use of dynamic high pressure treatment and biopreservation to achieve microbial stability in lager beer. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of nisin, lysozyme, hop aroma extract and sakacin were measured against two wild yeast strains from a brewery. Nisin was able to inhibit the growth of Pediococcus sp (2.0 mg.L-1), L. brevis (3.0 mg.L-1) and L. delbruecki (0.8 mg.L-1), although the wild yeasts and A. aceti were not inhibited up to 0.2 g.L-1. Lysozyme inhibited L. delbruecki (1.0 mg.L-1) and showed a transitory inhibition of L. brevis (50 mg.L-1). None of the biopreservatives inhibited the wild yeasts. High dynamic pressure was applied to the same strains at 60, 150, 100, 250 MPa in beer (pH 4.5, 2.5oP, 4.7oGL). The logarithmic number of reductions rate (Dp) was calculated. A multiple pass experiment was performed at sublethal pressures for up to 3 passes for the most resistant strain. All strains were totally inactivated at pressures of up to 250 MPa even at high initial counts (106CFU/mL). L. delbruecki was the most resistant strain. The Dp was 38.9 MPa. The multiple pass assays showed an additive effect, synergism or the selection of resistant bacteria not being observed. The effect of the inlet temperature (6, 10, 20, 23, 30, 44, 50oC) and CO2 content in beer (0, 0.5, 1.0 and 2.0 volumes at 25oC) on the destruction of Lactobacillus delbruecki by dynamic high pressure at 150 MPa and 170 MPa was evaluated: the inlet temperature showed a significant positive effect on the destruction of the strain and a 3 log destruction difference was observed between 6 and 50oC. The increase in concentration of CO2 showed a negative effect on the destruction. Lactobacillus brevis was used in the combination of high pressure and lysozyme assay, because it showed higher resistance to antimicrobials than L. delbruecki, and was the second microorganism in resistance to the high pressure treatment. The inhibition by lysozyme was transitory. Lysozyme alone, added at 50 mg.L-1 to the suspension, caused a reduction of 1 logarithmic cycle after two hours of contact. The DHP treatment against L. brevis resulted in a reduction of 7 log cycles at 200 MPa. Lysozyme was resistant to DHP, with no loss of muramidase activity until 200 MPa or significant loss of antimicrobial power. A combined treatment was applied using 50 mg.L-1 of lysozyme and a pressure between 150 and 170 Mpa. The somatic effect showed a reduction of about 6 logarithmic cycles and the L. brevis count remained stable after the pressure treatment for a week with the samples stored at room temperature (25oC). L. brevis was inoculated into beer (106 CFU.mL-1), containing 100 mg.L-1 of lysozyme, left for one hour and then treated by dynamic high pressure at 100 or 140 MPa. Samples were taken for survivor enumeration. Lysozyme promoted a destruction of one log cycle in L. brevis after one hour of contact and the subsequent DHP treatment reduced a further one log cycle and 4 log cycles at 100 and 140 MPa, respectively. The treated samples showed complete reduction of the initial load of microorganisms after 10 days of storage. Nisin alone proved to be useful in the control of Lactobacilli in beer, and was shown to be resistant to the high pressure treatment. The effect of the dynamic high pressure treatment was evaluated in the quality parameters of turbidity, colour and redox potential of Lager beer. Lager beer, unfiltered and not physico-chemically stabilized, was treated by dynamic high pressure from 100 to 300 MPa at 25oC. The colour and permanent turbidity were measured using the CieL*a*b* and ASBC/Hunterlab standards. The redox potential was determined by the indicator time test method for the 250 MPa treatments. Samples treated at 250 MPa were stored under ambient conditions for 100 days and the turbidity (ASBC), colour (ASBC) and redox potential value measured periodically. The results showed that the process was effective in retaining the beer colour, altough higher pressures (>200MPa) caused the turbidity to increase up to five fold (300 MPa). The storage results showed good colour stability and redox potential evolution, however the turbidity increased to 140 FTU in one month, and a precipitate formed. DHP proved itself to be a effective the method for microbial stabilization of beer, and can be effectively associated with other control methods, such as biopreservatives. Gram negative strains and wild yeasts although resistant to biopreservatives, were clearly sensitive to pressure treatment. Further work should be performed with filtered beer to evaluate if a reduction in the pressure due to the combined use of treatments would improve the quality with respect to turbidity, which was negatively affected by the dynamic high pressure treatment, and shown to be a major drawback Ver menos