Avaliação de transcritos diferencialmente expressos neoplasias humanas com ORESTES
Tarcisio de Souza Peres
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP P415a
[Evaluation of differential expression profiles across neoplasic human samples using ORESTES (Opening reading frame)]
Campinas, SP : [s.n.], 2006.
162p. : il.
Orientador: Fernando Lopes Alberto
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: Durante todo o século XX, a pesquisa do câncer se desenvolveu de maneira sistemática, porém os últimos 25 anos foram notadamente caracterizados por rápidos avanços que geraram uma rica e complexa base de conhecimentos, evidenciando a doença dentro de um conjunto dinâmico de alterações no...
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Resumo: Durante todo o século XX, a pesquisa do câncer se desenvolveu de maneira sistemática, porém os últimos 25 anos foram notadamente caracterizados por rápidos avanços que geraram uma rica e complexa base de conhecimentos, evidenciando a doença dentro de um conjunto dinâmico de alterações no genoma. Desta forma, o entendimento completo dos fenômenos moleculares envolvidos na fisiopatologia das neoplasias depende do conhecimento dos diversos processos celulares e bioquímicos característicos da célula tumoral e que, porventura, a diferenciem da célula normal (GOLUB e SLONIM, 1999). Nesse trabalho buscamos o melhor entendimento das vias moleculares no processo neoplásico por meio da análise dos dados do Projeto Genoma Humano do Câncer (CAMARGO, 2001) com vistas à identificação de genes diferencialmente expressos nas neoplasias dos seguintes tecidos: mama, cólon, cabeça e pescoço, pulmão, sistema nervoso central, próstata, estômago, testículo e útero. A metodologia de geração dos transcritos utilizada pelo Projeto Genoma Humano do Câncer é conhecida como ORESTES (DIAS et al, 2000). Inicialmente, os dados de seqüenciamento (fragmentos ORESTES) foram agrupados por meio de uma técnica conhecida em Bioinformática como ¿montagem¿, utilizando o pacote de programas de computador PHRED/PHRAP (EWING e GREEN P., 1998). A comparação de cada agrupamento com seqüências conhecidas (depositadas em bases públicas) foi realizada por meio do algoritmo BLAST (ALTSCHUL et al, 1990). Um subconjunto de genes foi selecionado com base em critérios específicos e submetido à avaliação de seus níveis de expressão em diferentes tecidos com base em abordagem de inferência Bayesiana (CHEN et al, 1998), em contraposição às abordagens mais clássicas, como testes de hipótese nula (AUDIC e CLAVERIE, 1997). A inferência Bayesiana foi viabilizada pelo desenvolvimento de uma ferramenta computacional escrita em linguagem PERL (PERES et al, 2005). Com o apoio da literatura, foi criada uma lista de genes relacionados ao fenômeno neoplásico. Esta lista foi confrontada com as informações de expressão gênica, constituindo-se em um dos parâmetros de um sistema de classificação (definido para a seleção dos genes de interesse). Desta forma, parte da base de conhecimento sobre câncer foi utilizada em conjunto com os dados de expressão gênica inferidos a partir dos fragmentos ORESTES. Para contextualização biológica da informação gerada, os genes foram classificados segundo nomenclatura GO (ASHBURNER et al, 2000) e KEGG (OGATA et al, 1999). Parte dos genes apontados como diferencialmente expressos em pelo menos um tecido tumoral, em relação ao seu equivalente normal, integram vias relacionadas ao fenômeno neoplásico (HAHN e WEINBERG, 2002). Dos genes associados a estas vias, 52% deles possuíam fator de expressão diferencial (em módulo) superior a cinco. Finalmente, dez entre os genes classificados foram escolhidos para confirmação experimental dos achados. Os resultados de qPCR em amostras de tecido gástrico normal e neoplásico foram compatíveis com com os dados de expressão gênica inferidos a partir dos fragmentos ORESTES
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Abstract: The XXth century showed the development in cancer research in a systematic way, most notably in the last 25 years that were characterized by rapid advances that generated a rich and complex body of knowledge, highlighting the disease within a dynamic group of changes in the genome. The...
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Abstract: The XXth century showed the development in cancer research in a systematic way, most notably in the last 25 years that were characterized by rapid advances that generated a rich and complex body of knowledge, highlighting the disease within a dynamic group of changes in the genome. The complete understanding of the molecular phenomena involved in the physiopathology of neoplasia is based upon the knowledge of the varied cellular and biochemical processes which are characteristic of the tumor and which make it different from the normal cell (GOLUB e SLONIM, 1999) In this work, we investigated the molecular pathways in the neoplasic process through data analyses of the cDNA sequences generated on the Human Cancer Genome Project (CAMARGO, 2001). The following neoplasias were included: breast, colon, head and neck, lungs, central nervous system, prostate gland, stomach, testicle and womb. The methodology of generation of transcripts used by the Genome Project of Human Cancer is known as ORESTES (DIAS et al, 2000). Initially, the sequence of data (ORESTES fragments) were grouped and assembled according to similarity scores. For this purpose, we used the package of computer programs PHRED/PHRAP (EWING e GREEN P., 1998). The resulting consensus sequences, each representing a cluster, were compared to known sequences (deposited in public databanks) through the BLAST algorithm (ALTSCHUL et al, 1990). A subgroup of genes was selected based on specific criteria and their levels of expression in different tissues were evaluated by a bayesian inference approach (CHEN et al, 1998), as compared to more classical approaches such as null hypothesis tests (AUDIC e CLAVERIE, 1997). The Bayesian inference tool was represented as a PERL script developed for this work. A list of genes, putatively related to the neoplasic phenotype, was created with the support of the literature. This list was compared to the gene expression information, becoming one of the parameters of a ranking system (defined for the selection of genes of interest). Therefore, part of the knowledge related to cancer was used together with the data of gene expression inferred from ORESTES fragments. For a more accurate understanding of the molecular pathways involved in the generated information, the genes were classified according to the Gene Ontology (ASHBURNER et al, 2000) and KEGG (OGATA et al, 1999) nomenclatures. Additional global analyses by pathways related to the neoplasic phenomenon (HAHN e WEINBERG, 2002) demonstrated differential expression of the selected genes. About 52% of the genes in this pathways were differentially expressed in tumor tissue with at least a 5-fold. Finally, ten genes were selected for experimental validation (in vitro) of the findings with real-time quantitative PCR, confirming in silico results
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